樱桃根癌病研究进展

来源：树科学研究所 作者：李淑平张福兴

根癌病是一种世界性植物细菌病害， 世界各地均有发生，可侵染93 科331 属643 种高等植物，在我国，桃树、樱桃、葡萄等多种果树受到根癌病危害， 现将樱桃方面的研究进展情况综述如下。
  1 根癌病病原菌的分类和形态特征根癌土壤杆菌属农杆菌属， 也称土壤杆菌属和根瘤菌属， 是不同于根瘤菌科的革兰氏阴性菌。土壤杆菌属根据致病性分为4 个种：根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、放射性农杆菌(Agrobacterium radiobactor)、毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) 和悬钩子农杆菌（Agrobacterium Rubi），其中，根癌农杆菌为根癌病的病原菌，它又可分为根癌土壤杆菌(原生物型I)、发根土壤杆菌(原生物型Ⅱ)和葡萄土壤杆菌(原生物型Ⅲ)3 个种。生物I 型寄主范围较广泛，生物Ⅱ型寄主主要是核果类植物，生物Ⅲ型是从葡萄中分离得到的。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacYens)为短杆状细菌，单生或链生，大小1~3 μm×0．4~0.8 μm，具1～6 根周生鞭毛，有运动性。若是单菌毛，则多为侧生。细菌内不含色素，具有Ti 质粒(tumer-inducing plasmid)，可引起植物根部皮层肿大。该细菌有荚膜，无芽孢，革兰氏染色呈阴性反应。在琼脂培养基上菌落白色、圆形、光
亮、透明，在液体培养基上微呈云状浑浊，表面有一层薄膜。不能使明胶液化，不能分解淀粉。发育最适温度为25～28 ℃，最高37 ℃，最低0 ℃，致死温度为51 ℃。发育最适酸碱度pH 值7.3，耐酸碱范围为pH 值5.7～9.2。60％的湿度最适宜病瘤的形成。
   2 樱桃根癌病菌鉴定分离培养分离方法： 王慧敏等将新采集到的樱桃根癌病组织幼嫩小瘤，洗净表面，切取0.2 g 新鲜组织置于0.5 ml 离心管中， 用镊子捣碎出汁，加2 滴无菌水浸渍， 用灭菌接种环沾取组织浸渍液在MW 平板上划线， 置于28 ℃恒温箱中培养1~2 d， 挑取典型单菌落继续在MW 平板上划线，进行单菌落纯化，直至1 个平板上单菌落形态一致。根围土的分离是取10 g 土加90 ml灭菌水， 震荡混匀， 吸取上清原液及其10－1、10－2 稀释液0.05ml，置MW 培养基上培养。培养基：张晓明用MW 培养基（甘露醇10 g，0.1%生物素0.1 ml，KH2PO4 0.3 g，Fe-EDTA 2 ml，NaNO3 5 g，0.1%结晶紫2 mlNaCl 0.2 g，琼脂18 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水1 000 ml）分离病菌；活化及菌种保存用改良523 培养基(蔗糖10 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO4 2 g，琼脂20 g，酵母膏10 g，CaCO3 5g，水1 000 ml，pH 值7.2)；李莹莹用LB或YEB 培养基培养。中国农业大学的王慧敏等从山东、河北、辽宁等地的樱桃园的樱桃冠瘿瘤和土壤样品中得到的46 株根癌土壤杆菌全部为胭脂碱型Ti 质粒，对放射土壤杆菌K84 产生的土壤杆菌素敏感。
   3 根癌病菌抗药性试验李健强等采用抑菌圈法测定了6 种杀菌剂和抗菌素对不同生物型根癌土壤杆菌的作用。结果表明， 福美双对生物Ⅲ型根癌菌所有菌株都有较强抑制作用，抑菌圈直径(DBA) 最大达23.2 mm，对Ⅰ、Ⅱ型的个别菌株也有轻微抑制作用；多菌灵、乙磷铝和加瑞农对3 种生物型的根癌菌无抑制作用；青霉素钠对Ⅰ、Ⅱ型根癌菌无抑制作用， 对Ⅲ型抑制作用较强， 最大DBA 为27 mm。硫酸链霉素对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型根癌菌抑制作用显著，DBA 最大值达40.8 mm。多菌灵、乙磷铝对3 种根癌抑制菌均无作用李莹莹采用纸片法检测了27 种中草药对根癌土壤杆菌的抑菌效果， 供试中药有金银花、广金钱草、半枝莲、大黄、泽泻、黄连、黄芩、穿心莲、白花蛇舌草、黄柏、荷叶、鸡骨草、车绒草、车前草、川乌、青黛、防气、火麻仁、猪苓、佩兰、草叩、桑叶、赤小豆、冬瓜皮、茯苓、野生柴胡、地伏子。结果表明，黄连的抑菌效果明显，其抑菌圈直径为22 mm，最低抑菌浓度(MIC)为15.62 mg/ml；大黄和穿心莲也有抑菌作用， 其抑菌圈直径分别为19.5 和18.9 mm，MIC 均为31.25 mg/ml。
  4 根癌病发病机理
   4.1 细菌附着根癌土壤杆菌首先附着在创伤部位的细胞壁上， 只有在创伤部位生存了16 h以后的细菌才能诱发肿瘤，这段时间称之为“细胞调节期”。在调节期，细菌中为植物转化所必须具备的功能都已经被诱导出来， 在细菌的附着过程中，有毒的及若干无毒的土壤杆菌，互相竞争植物细胞表面上数量有限的附着位点，竞争中， 如果无毒的土壤杆菌先于有毒的土壤杆菌接触到创伤部位，就不会形成肿瘤，反之则会形成肿瘤。K84 菌株防治根癌病的机理就是由于它抢先占领了果树伤口位点， 在其上定植并产生农杆菌素， 阻止其它病菌从伤口侵入，因此它的作用是预防而不是治疗，其治疗效果较差。附着到植物细胞壁上之后， 土壤杆菌便会产生出细微的纤丝而将自身缚附在壁的表面，同时别的细菌也会被包陷在由这种细丝组成的网络之中， 从而最终在植物细胞壁上出现细菌集结，随后，根癌土壤杆菌便将它的一种遗传信息片断导入因创伤而被“调节”的植物细胞内，并使之转化成肿瘤细胞，进而形成冠瘿瘤。
   4.2 冠瘿瘤冠瘿是一种植物肿瘤， 一堆未分化的组织团。由于水分运输和营养运输受到干扰，往往会导致生长减缓，甚至出现病态。冠瘿瘤细胞具有异常的失控生长能力。冠瘿细胞能够合成称为冠瘿碱的化合物， 这是一类正常植物细胞不能合成的低分子量的碱性氨基酸衍生物， 根瘤土壤杆菌选择性的利用这些化合物作为自己唯一的能源、碳源和氮源。
   4.3 冠瘿瘤诱发的遗传本质植物冠瘿瘤诱发的遗传本质是土壤杆菌细胞中的致瘤质粒—Ti 质粒的侵染所致，Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质， 为双股共价闭合的环状DNA 分子，约有150～200 kb，在病原菌致病过程中，其中的一段DNA 分子（T-DNA）能够插入到植物基因组中并能够稳定表达。人们已经绘制出了根瘤土壤杆菌的Ti 质粒及其T-DNA的遗传图，T-DNA 区段中， 至少存在着4 个有转录活性的开放读码结构。①编码胭脂碱合成酶的基因（nos）。②细胞分裂素生物合成酶（tmr）又叫做根性肿瘤基因，编码异戊烯转移酶，能催化细胞分裂素的合成。③参与控制植物生长素合成的基因（tms），它分为tms1 和tms2，分别编码色氨酸2－单加氧酶和吲哚乙酰胺水解酶，它们将色氨酸转化为吲哚乙酸。④大肿瘤基因tml的转录本6a 和6b 以及转录本5， 它们转译的产物以非激素的方式抑制自身细胞的分化，因
此形成大型的冠瘿瘤。Ti 质粒诱发冠瘿瘤有3 种遗传成分，一是决定植物形成冠瘿瘤的T 区段为T-DNA 即转移DNA， 它是Ti 质粒基因组中被转移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定DNA 片段；第二种是vir 基因， 它同样也位于Ti 质DNA上，其编码产物为反式作用蛋白质，是植物细胞转化的必要因子； 第三种是间接参与植物细胞转化的基因，由染色体基因组编码，其表达产物的功能是使细菌细胞结合到感染植物的创伤部位。尽管诱导植物产生冠瘿瘤需要Ti 质粒的存在，但是一旦植物确立了产瘤生长模式后，继续维持肿瘤生长就不再需要Ti 质粒了。在冠瘿瘤细胞中，并未能找到完整的Ti 质粒的DNA，从感染植物的不同细胞器，包括细胞核、线粒体、叶绿体等制备DNA，然后分别同经过放射性核素32P 标记的T 区段探针进行杂交，结果只有核DNA 呈现阳性反应， 表明T 区段整合在植物的细胞核基因组上。植物冠瘿瘤细胞中冠瘿碱的合成和不依赖于植物激素的生长能力，都是由编码在T－DNA 上的基因控制的， 根癌农
杆菌通过Ti 质粒的转化作用，实现了植物基因的遗传转移。
   5 抗性砧木筛选培育
   5.1 筛选张晓明等建立了应用水培接种检测樱桃砧木抗根癌能力的方法， 并使用该方法对常用的樱桃砧木大叶草樱和对樱抗根癌能力进行鉴定。结果表明，对樱对根癌病的抗病能力要好于大叶草樱。赵玉辉在5 种樱桃砧木，对樱、CAB、Gisela 5、Gisela 6、Colt 的组培苗茎上接种野生型农杆菌(c58)，40 d 后调查结瘤百分率和瘤重，基于结瘤百分率和病情指数评价了供试材料的敏感性，结果表明：该方法能反映不同砧木的抗性水平。可作为樱桃砧木根癌病敏感性评价、筛选抗性种质的一种有效的方法，对根癌抗性顺序是：对樱>Colt > CAB > Gisela 5> Gisela 6。高东升等研究了根癌病对生产中常用的樱桃砧木生长发育及氮磷分配的影响效应， 结果表明， 根癌病菌能显著抑制新梢和茎干粗度的生长，并使树体叶绿素含量降低，导致树体光合速率下降，但下降幅度与树体抗性有关，树体抗性愈强，下降幅度愈小，根癌病菌能促进患病植株的根系活力， 根系活力的升高能促进冠瘿瘤的生长发育，但没有促进树体的生长，冠瘿瘤是强生长中心，将发病率、冠瘿瘤平均瘤径和植株长势三个指标结合不同樱桃砧木的抗癌能力进
行综合评价，得出，高感：圆叶大青叶、考特、马扎德、山樱；中感：莱阳矮樱桃；中抗：中国樱桃；高抗：大青叶。
   5.2 培育要从根本上解决根瘤病的发生，培育抗性砧木是关键， 除用常规育种方法筛选抗性砧木外， 通过基因工程手段直接将抗病基因导入到植物的基因组中， 使其在植物中稳定表达和遗传，从而获得抗病新品系，开辟了植物抗病育种的新时代。抗菌肽是某些昆虫在经外部刺激后， 产生的具有抗菌作用， 分子量在4 KD 作用的肽类物质，抗菌肽具有光谱杀菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有明显的杀菌作用，此外对某些真菌、病毒及肿瘤细胞也具有抗性。在植物抗病育种上有着良好的发展前景。辽宁师范大学郭绍华用携带抗菌肽基因的根癌农杆菌转化樱桃砧木考特，获得9 个转化克隆系，抗菌肽基因在植株中表达，转化植株接种后均能正常生长，在接菌部位未形成冠瘿瘤。西北农林科技大学黄文江把抗菌肽MB 39 基因转入Gisela
   6 砧木，获得抗根癌病的植株。应用RNA 干扰技术，关闭控制细胞分裂素和生长素合成的基因， 在苹果上已经获得抗根癌病植株。在樱桃砧木培育中，也可以尝试应用此方法，培育抗性砧木。
   6 根癌病的预防选择合适的苗圃地是减少根癌病传播的关
键。苗圃应选在未感病的地块，培育无病壮苗。避免造成机械伤口，防止病菌由伤口侵入。澳大利亚首先分离出K84 菌株， 能有效拮抗根癌农杆菌，用国内生产的“抗根癌菌剂1 号”在苗木定植时进行蘸根处理（1 份菌剂对2~3 份水） 可有效地减轻根癌农杆菌的危害，即减少发病株率，推迟发病年限，并减轻植株受害的程度。但抗根癌菌剂处理不能完全消除根癌病。