小研Pgk2在小鼠中的年龄依赖性表达特征分析
0 引言哺乳动物的精子发生是一个高度有序的过程，包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形反应三个阶段[1]。研究发现，这三个阶段有很多睾丸特异性基因参与其中的生理发育过程[2]。
目前人类对于哺乳动物精子发生这一过程中许多关键基因及其功能还知之甚少，需要进行更加广泛深入的研究。我们通过对4d、9d、18d、35d、54d 和6 月龄小鼠睾丸全基因表达谱的Affymetrix 芯片分析，并结合RT-PCR 实验，筛选得到一个小鼠年龄依赖性表达基因，Pgk2。该基因在小鼠4 日龄小鼠睾丸中无表达，9 日龄小鼠睾丸中微表达，在18、35 和54日龄小鼠睾丸组织中表达量显著增加。据报道［3］，该基因仅在睾丸中表达，因此我们可以推测这个基因可能在小鼠的精子发生过程中起着重要作用。本文采用了基因芯片和分子生物学技术对该基因在小鼠中的年龄依赖性表达特征做一分析。
0.1 材料和方法
0.1.1 材料
RNA 抽提试剂盒购自Gentra 公司，RT-PCR 试剂盒购自Ferments 公司。小鼠扩增引物由上海生工合成。电泳试剂、dNTP 均购自上海生工。4 日至6 月龄小鼠，购自中山大学实验动物中心。
0.1.2 小鼠睾丸全基因组ＤＮＡ芯片分析
小鼠全基因组芯片购自Affymetrix 公司，所有实验操作过程参照该公司实验手册。
0.1.3 小鼠各组织总 RNA 的抽提
取4、9、l8、35、54 日龄和6 月龄小鼠睾丸组织按照RNA 抽提试剂盒说明书方法抽提各组织总RNA。
0.1.4 RT-PCR 扩增
按照逆转录试剂盒说明书中方法合成cDNA，以该cDNA 为模板对Pgk2 基因外显子区域进行扩增。在25μl 的反应总体积中加入下列物质：cDNA 1μl，dNTP 5μl，10 X Buffer 缓冲液2.5μl，Depc 处理水16.5μl。PCR 扩增条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性30 sec，53℃退火30 sec，72℃延伸20 sec，30 个循环，72℃延伸10min，反应结束后置4℃保存，1.5%琼脂糖电泳检测PCR 产物大小并采用BandScan 5.0 分析其相对表达量，剩余的RT-PCR产物送深圳华大基因研究院测序，以确证PCR 扩增的目的片段是Pgk2 基因。引物序列。
0.2 结果
0.2.1 Affymetrix 芯片分析结果
代表Pgk2 的Affymetrix 芯片探针的杂交信号校正值在4d、9d、18d、35d、54d 和6 月龄小鼠睾丸中分别是1.7(A)、161.5(P)、634(P)、1881.3(P)、3123.7(P)和3440.4(P)。A：Absent，表示在芯片上不表达，P：Present，表示在芯片上表达。可见探针所代表的Pgk2在4d 小鼠睾丸组织中不表达，在9d、18d 龄小鼠睾丸组织中低表达，35d 后开始呈现高表达。以β-actin 为内参，其芯片杂交信号校正值依次是3688.88、3764.478、3812.9、3696.87、3679.71 和3757.12。
0.2.2 不同年龄小鼠睾丸组织RT-PCR 结果分析
4d、9d、l8d、35d、54d 小鼠睾丸组织RT-PCR 电泳结果和灰度比较结果表明：Pgk2 基因在小鼠出生后35d 和54d 小鼠睾丸中表达量较高，而35d 至54d 小鼠生精上皮排列为成熟型，可见各级生精细胞，管腔内可见释放的成熟精子。Pgk2 基因在小鼠睾丸中的表达与精子发生过程中生精细胞发育的进程是一致的。
1 讨论
精子发生是一个极其复杂的过程，睾丸内的精子发生包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂和精子细胞变形，最终产生未成熟精子进入附睾，许多在睾丸中特异或高度表达的基因参与了这一过程 [4]。在精子发生过程中有许多年龄依赖性基因表达，分析睾丸中这些年龄依赖性基因的表达特征和生物学功能，对理解精子发生的内在机理，防治由精子发生异常引起的男性不育，研制靶向性男性计划生育药物等具有重要意义。
在哺乳动物基因组中有两种PGK 酶（磷酸甘油酸激酶，Phosphoglycerate kinase，Pgk），其一是Pgk-1，它是X 连锁，且在所有的体细胞中都有表达；其二是Pgk-2，它位于常染色体19p133，主要在睾丸中表达，这个基因无内含子，而且只在精子发生细胞中表达。Pgk-2基因的功能是补偿由于X 染色体在精母细胞中的失活所导致Pgk-1 的抑制表达［3］。另外，PGK1 酶向PGK2 酶的转变是发生在mRNA 水平的，Pgk-2 基因启动子的上游存在一个沉默子样的负性调控元件，该顺式作用元件调节Pgk2 基因按特定的模式表达[5]。
本实验采用基因芯片技术，发现在所检测的小鼠4d、9d、18d、35d 和54d 小鼠睾丸组织中，Pgk2 基因在35d 和54d 小鼠睾丸中高表达，利用RT-PCR 方法进一步验证，发现基因在4 和9d 小鼠睾丸无表达和低表达，在18、35 和54 日龄小鼠睾丸组织中表达量显著增加，Pgk2 的这一表达特点与精子发生过程相符。精子发生是在小鼠出生时开始，并随着小鼠的成长逐步发生各阶段的变化。小鼠出生后9-10 天，生精细胞开始发生减数分裂，14-15天粗线期精母细胞出现，22 天可以见到单倍体圆形精子[6]。据报道，Pgk2 基因仅在减数分裂和单倍体雄性生殖细胞中表达 [7] 。本实验结果发现18d 小鼠Pgk2 基因开始高表达，恰巧是在减数分裂期。而在此之前的4d，9d 小鼠中Pgk2 不表达或者仅少量表达，是因为精子细胞还未进入减数分裂期。由此可见，pgk2 基因的表达与小鼠年龄具有一定的相关性。
Pgk2 基因的互作蛋白及其所处的细胞信号通道等研究正在笔者所在实验室里进行。这些工作的顺利开展，将为解释Pgk2 基因在人和小鼠睾丸发育、精子发生和受精中的确切功能提供重要的实验证据。
参考文献
[1] Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells[J]. Methods Enzymol. 1993,225:84–113
[2] Almstrup, K., J. E. Nielsen, M. A. Hansen, et al. Analysis of cell-type-specific gene expression during mousespermatogenesis[J]. Biol. Reprod. 2004, 70:1751–1761.
[3] John RMcCarrey,Meena Kumari,Mary Jo Aivaliotis, et al. Analysis of the cDNA and encoded protein of thehuman testis specific PGK-2 gene[J]. Developmental Genetics, 1996, 19( 4): 321～2210
[4] Grimes SR. Testis-specific transcriptional control[J]. Gene, 2004, 343(1):11-22
[5] M Goto, Y Masamune, and Y Nakanishi. A factor stimulating transcription of the testis-specific Pgk-2 generecognizes a sequence similar to the binding site for a transcription inhibitor of the somatic-type Pgk-1 gene[J] .Nucleic Acids Res. 1993, 21(2): 209–214.
[6] Bellve, A. R., Cavicchia, J. C., Millette, C. F.et al . Spermatogenic cells of the prepuberal mouse, isolationand morphological characterization[J] . J . Cell Biol, 1977, 74 , 68-85