关于人HSP70表达载体的构建及在无细胞中的表达
1 引言热休克蛋白 （Heat Shock Protein ，HSP）,是在细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质，是细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质，在生物界的进化过程中具有高度保守性[1,2]，例如，从大肠杆菌、酵母、果蝇和人体分离的分子量为70kD 的HSP，全氨基酸序列具有80%以上的相似性，说明它们的重要生理功能具有普遍存在性，据研究热休克蛋白参与多种胞内蛋白的折叠和组装，具有提高细胞的应激能力，调节Na+-K+-ATP 酶的活性，增强对各种损伤的抵抗力，保护细胞的作用[3,4]。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子热休克蛋白，近年研究发现，HSP70 与某些肿瘤疾病的发生与发展密切相关，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用[5-7]。如何实现HSP70 蛋白的有效表达一直是热休克蛋白家族研究中的热点。随着基因组学和蛋白质组学研究的快速发展，无细胞体外表达技术逐渐成为人们关注的焦点，体外无细胞表达技术的原理基于蛋白质的合成不依赖于细胞的完整性，是将参与翻译的核糖体、tRNA、翻译延伸因子、终止因子、氨基酸、ATP 等从细胞中提取出来制成混合物，以mRNA为模板在体外合成蛋白质的过程[8]。因为突破了细胞的限制，不需要花时间克隆、转染、培养细胞、筛选重组克隆[9.10]，只需几个小时就1可以得到表达产物，大大节约了时间和劳动力。
基于此本研究中构建了带有-myc 标签的pCMV- HSP70-myc 表达载体，并利用体外无细胞表达技术实现了HSP70 在体外的快速表达，为进一步探讨HSP70 的生理功能及在肿瘤中的作用奠定了基础。
2 试验材料
PCR 扩增所用的Tag 酶为预混的高保真酶，购自北京GeneStar 生物公司；兔网织红细胞体外表达体系（TNT? Coupled Reticulocyte Lysate Systems）购自美国Promega 公司；T4DNA 连接酶购自NEB 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Promega 公司；鼠c-myc 单克隆抗体和HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自天根生化科技有限公司； PCR 引物由北京赛百胜生物公司合成；内切酶及其所用的缓冲液、PCR 所用缓冲液及相关酶制剂、DNA分子量Marker（DL2000）等均购自大连宝生物工程有限公司；醋酸纤维素膜（NC 膜，Triton-100）购自美国Sigma 公司，其他试剂均为国产分析纯。
PCR 仪，GeneAmp PCR System 9700，购自Applied Biosystems 公司；超净台，购自哈东联仪器厂；蜗旋震荡仪，购自韩国QUALITRON 公司；摇床，购自江苏海门其林贝尔仪器厂；低温离心机（5415R），购自eppendorf 公司。
3 试验方法
3.1 HSP70 基因的克隆
根据热休克蛋白HSP70 的基因序列，用软件Primer5.0 设计一对引物，并在上游引物中插入SalI 酶切位点，在下游引物中插入NotI 酶切位点，酶切位点外加上4～6 个保护碱基，引物序列如下：
上游引物：5′-CATCCGGTCGACCATGGCTACTGCCAAGGGAATC-3′下游引物：5′—GTTTAGCGGCCGCATCTACTTCTTCAATTGTGGG—3′其中下划线部分为酶切位点的序列，以本实验室所构建的肝cDNA 文库为模板,通过PCR 扩增获得HSP70 基因片段，PCR 反应条件：94℃预变性2min； 94℃变性1min, 53℃退火1min,72℃延伸2min，循环5 次；94℃变性1min, 55℃退火1min,72℃延伸2min，循环30 次；72℃延伸7min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。
3.2 酶切HSP70 基因和pCMV-myc 载体
分别对 HSP70 基因PCR 回收产物和pCMV-myc 质粒进行限制性内切酶双酶切，HSP70基因PCR 回收产物50ul 酶切体系：10×H buffer 5ul,PCR 回收产物 15ul,SalI 内切酶(10U/ul)3ul,NotI 内切酶(10U/ul)3ul,ddH2O 24ul,反应混合物37℃酶切过夜；pCMV-myc 载体50ul 酶切体系：10×H buffer 5ul,载体质粒 (289.5ng/ul) 4ul,SalI 内切酶(10U/ul)3ul,NotI 内切酶(10U/ul)3ul,ddH2O 35ul,反应混合物37℃酶切过夜。酶切反应结束后，跑1.0%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。
3.3 pCMV- HSP70 -myc 载体构建
将酶切成功的HSP70 目的片段和pCMV-myc 载体进行连接，连接酶为NEB 的T4 连接酶，连接体系10ul：10×NEB buffer 1ul，目的片段 7ul,载体 1ul,NEB T4 连接酶 1ul, 4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109，转化步骤如下：（1）在10μL 连接体系中加入100μL Jm109 感受态，于冰水混合浴中孵育30 分钟；（2）42℃水浴90 秒热激；（3）热激后迅速转移至冰上，孵育2 分钟；（4）在消毒灭菌过的超净台内加无抗性LB 液体培养基600μL，37℃，150r/m 摇床上摇菌45 分钟；（5）转化后的菌液均匀铺到含有1‰卡那抗生素的普通琼脂平板上，待液体完全吸收后倒置平板，37℃培养过夜，16-18h 后鉴定重组子，经双酶切验证阳性的重组质粒送测序公司测序鉴定。
3.4 HSP70 的体外无细胞表达
将鉴定正确的重组质粒pCMV- HSP70 -myc 和pCMV-myc 空质粒保存菌液用含有1‰卡那抗生素的LB 液体培养基过夜增菌后提取质粒，室温下快速溶解兔网织红细胞体外表达体系的各组分：TNT? Reaction Buffer；Amino Acid Mixture, Minus Leucine；Amino AcidMixture, Minus Methionine 和 RNase-free H2O，完全溶解后置于冰上，使用前混匀。所有试剂组分准备好后，按照如下所示在RNase-free 500μL EP 管中依次加入各组分涡旋混匀管内混合物，轻微离心后，置于30℃恒温水浴箱中孵育90 分钟，进行体外的偶联转录翻译反应。
3.5 Western blot 鉴定无细胞表达产物
无细胞体系表达产物与2×SDS loading buffer 按 1：1 的比例混合后煮沸10 分钟，取20uL煮沸变性的 pCMV- HSP70 -myc 无细胞表达产物和pCMV-myc 空质粒无细胞表达产物进行SDS-PAGE 凝胶电泳， 分离后的蛋白用半干电转法转移到硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1 小时,一抗为抗 c-Myc 单克隆抗体（1：1000），4℃孵育过夜，HRP 标记的羊抗鼠IgG（1：2000） 做为二抗室温封闭1 小时后，加入的ECL 化学发光试剂置于暗盒中用X 光胶片曝光检测。
4 结果
4.1 HSP70 基因的克隆
HSP70 基因目的片段要通过酶切位点连接到真核表达载体上，因此本研究中在HSP70基因上游引物的5′端引入SalI 酶切位点，下游引物的5′端引入NotI 酶切位点，并在酶切位点外加上4-6 个保护碱基，提高内切酶的切割效率，PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果所示。
4.2 重组pCMV- HSP70 -myc 质粒的鉴定
按照 3.3 的策略进行pCMV- HSP70 -myc 载体的构建，HSP70 基因DNA 序列约为1926bp,pCMV-myc 载体全序列约为3.8kb,重组质粒经过 SalI 和NotI 双酶切验证后得到的基因片段大小与理论值基本相符，如图2 所示，酶切鉴定成功的重组质粒送华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果表明AFP 基因片段已经成功正向构建到了pCMV-myc 载体上，经过与GeneBank 比较,AFP 基因的序列同源性99%，且读码框正确，基因测序结果如图3所示。
4.3 重组质粒的体外无细胞表达
用 Promega 公司的质粒提取试剂盒提取pCMV- HSP70 -myc 重组质粒（实验组）和pCMV-myc 载体空质粒（阴性对照组），分光光度计测得pCMV- HSP70 -myc 浓度为521.5ng/ul, pCMV-myc 浓度为480.2ng/ul,按照3.5 小节中的无细胞体外表达技术进行体外的转录翻译反应。反应结束后，用免疫印迹法（Western blot，WB）检测AFP 的体外表达情况，鼠抗-Myc 标签的单克隆抗体做为一抗检测AFP 蛋白的表达水平，WB 检测结果如图4所示，从图4 中可以看出在实验组中确实有HSP70 蛋白的表达，大小约为79.6KDa(包括c-myc标签大小)，与我们理论计算值相符；而在对照组中没有HSP70 蛋白的表达条带。
5 讨论
HSP70 是热休克蛋白家族中最重要的一族，分子量约为70KDa,具有高度保守的氨基酸序列，种属间同源性很高，在所有的原核细胞和真核细胞中都有表达，是目前发现的ATP依赖的主要分子伴侣之一，对增加机体的抵抗力、保护机体免受外来因素的侵害具有重要作用。近来研究发现HSP70 还具有抗肿瘤免疫的功能，HSP70 与肿瘤抗原肽以非共价键方式结合，形成HSP70-抗原肽复合物，通过抗原提呈细胞激发特异的抗肿瘤免疫应答[11,12]，因此HSP70 在肿瘤诊断和制备抗肿瘤疫苗的研究中具有重要意义，但是目前HSP70 在体外细胞中表达还有很多问题亟待解决，如表达产物不稳定，原核表达易形成包涵体难以复性，某些表达产物对宿主细胞有毒性侵害等等。而无细胞表达技术由于突破了细胞的限制所以不会受到上述问题的干扰，并且具有操作简便，耗时短（整个表达过程只需90 分钟），无需转染和筛选重组克隆等优点[13,14]，目前利用体外无细胞表达技术进行蛋白合成最常用的3 类体系是原核的大肠杆菌体系(E. coli-based systems)、真核的兔网织红细胞体系(rabbit reticulocytesystems)和麦胚细胞体系(wheat germsystems)[15,16] 。
基于无细胞表达技术的诸多优点，本研究中构建了pCMV- HSP70-myc 载体，采用体外无细胞表达系统对HSP70 基因进行体外的偶联转录翻译过程，并用Western blot 方法验证了HSP70 的无细胞表达产物分子量与理论值大小相符，证实了HSP70 无细胞表达的可靠性，成功的实现了HSP70 的体外快速表达，为进一步探讨HSP70 的生物学功能以及在抗肿瘤中发挥的作用奠定了基础，也为一些难以表达的跨膜蛋白的研究提供了新的平台。