小研巴西橡胶树HbHEX1基因的克隆
同源异型盒（homeobox, HB）蛋白是一类与发育有关的重要转录因子。这类转录因子的一个显著特征是含有由60 个氨基酸组成的高度保守的结构域-- 同源异型域（homomeodomain, HD）[1]。第一个编码同源异型盒蛋白的基因在果蝇中被发现，因其突变或异位表达均能引起同源异型突变而得名。随后在其它动物、植物和真菌中相继发现了类似的同源异型盒蛋白基因[2,3]。KNOTTED1（KN1 或ZmKN1）是第一个从植物中分离出来的同源异型盒基因，该基因突变造成叶脉附近形成手指状突起结构[4]。目前从拟南芥、水稻、大麦、番茄等植物中克隆到大量同源异型盒基因[5-10]。在植物中，同源异型盒蛋白除了HD 结构域外，还包含了其他保守结构域。根据植物HB 蛋白中HD 基序的位置和序列差异，及其两侧序列的同源性和其他保守结构域的不同， Bharathan 等将同源异型盒蛋白划分成7 类： KNOX， BEL,ZM-HOX, HAT1, HAT2, ATHB8 和 GL2， 其中HAT1, HAT2, ATHB8 和GL2 在HD 的下游含有亮氨酸拉链基序（leucine-zipper motif）,也命名为HD-ZIP I, HD-ZIP II, HD-ZIP III 和HD-ZIP IV [5-7]. 最近Mukherjee 等将同源异型盒蛋白划分成14 类：HD-ZIP I - IV, PLINC,WOX, NDX, DDT, PHD, LD, PINTOX, SAWADEE, KNOX 和 BEL[1]。
同源异型盒基因编码控制多细胞真核生物发育的转录因子，参与调控细胞分化的命运，在生物的形态建成中发挥着重要作用[1]。如KNOX1 主要在植物分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必需的关键基因，调控与器官发生相关的细胞分化，最终影响侧生器官的形态建成[4]；HD- ZIP 蛋白在植物中起着重要的作用，如维管发育、器官形成、分生组织的维持和逆境应答等[8-16]。目前在橡胶树中还未见到相关同源异型盒基因的报道，本研究利用一个从巴西橡树胶乳cDNA 文库中的EST 片段的序列信息设计引物，通过RACE 的方法获得了橡胶树编码homeobox 蛋白的cDNA（命名为HbHEX1），并对其表达进行了初步研究，为进一步了解同源异型盒蛋白基因在橡胶树中的生物学功能打下基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）采自中国热带农业科学院的实验农场。胶乳的采样按Tang 等（2007）的方法[17]进行，然后用液氮收集。叶片、花和芽摘取后用液氮研磨，于-70℃保存。愈伤组织和体细胞胚由陈雄庭研究员提供，用液氮研磨，于-70℃保存。
1.2 质粒、菌种及试剂
克隆载体 pGEM-T easy Vector、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4-DNA 连接酶，RNAPCR(AMV)Ver.3.0、5’-full RACE Core Set 均购自TaKaRa 公司。E.coli DH5α 由本实验室保存。IPTG、X-gal、dNTPs 购于Promega 公司；其它生化试剂和常规试剂均为超纯和分析纯。
1.3 橡胶树RNA 的提取
参照 Tang 等（2007）提取方法[17]进行。
1.4 用于5’RACE 扩增的cDNA 的合成
根据 TaKaRa 公司的5’-full RACE Core Set 试剂盒说明书进行操作。
1.5 5’RACE 扩增
根据巴西橡树胶乳cDNA 文库中的EST 片段的序列信息，设计5’RACE 引物： P1：
5’-CACTTCTATTACTGCAAGAACCCTCGG-3’ ； P2 ：
5’-CCGAGGGTTCTTGCAGTAATAGAAGT
G-3’。 5’RACE 扩增按照TaKaRa 公司的5’-full RACE Core Set 试剂盒说明书进行。
1.6 全长cDNA 的PCR 扩增
根据已获得的HbHEX1 的5’端序列和序列拼接结果设计引物： P1 ：5’-ATGACTTGCAATGGGATGGCTT-3’； P2：5’-TCAATTGAAGTGTTGCTGCTCAAGC-3’。用于5’RACE 扩增的cDNA 第一链为模板，94℃预变性3min 后加入Taq DNA 聚合酶，进行PCR 反应。反应体系为：在0.2 mL 的离心管中加入10 × PCR 缓冲液 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、25 mmol/L dNTP 2 μL、引物各2.5 μL (50 μmol/L)，1μL cDNA，加ddH2O 总体积为25 μL。反应的条件为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35 个循环后继续延伸10min。
1.7 PCR 扩增产物的克隆及测序
PCR 产物的克隆按分子克隆实验指南[18]的方法进行，测序由英骏生物技术有限公司完成。
1.8 核苷酸及相应氨基酸序列分析
通过和NCBI的核酸、蛋白质结构特征在线分析工具对推导的HbHEX1 氨基酸序列进行分析。
1.9 HbHEX1 半定量PT-PCR 分析
提取不同样品的RNA 后，进行反转录以actin 作为内参，进行RT-PCR 半定量分析。HbHEX1 半定量RT-PCR 分析的引物为： P1：5’-CTATGACCTCCTCAAGAGACAG -3’； P2：5’-TATGGCAGTAGCAGAAGTATCG-3’ 。actin 引物为： actinF ：5’-CAGTGGTCGACAACTGGTAT-3’； actinR：5’-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3’。反应体系为：在0.2 mL 的离心管中加入10 × PCR 缓冲液 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 2 μL、25 mmol/L dNTP 2 μL、引物各2.5 μL(50 μmol/L)，1μL cDNA，加ddH2O 总体积为25 μL。PCR 反应条件为94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，22 个循环。
2 结果与分析
2.1 HbHEX1 基因的克隆
在先前的研究中，我们一个巴西橡树胶乳cDNA 文库中的EST 片段，该片段长915 bp。BlastX 分析表明该片段编码的氨基酸与蓖麻（Ricinus communis）的homeobox 蛋白的同源性达到了90％，该片段含有部分ORF 和447 bp 的3’-UTR 。根据该EST 序列设计引物，通过5’-RACE 技术获得了800bp 的片段，将获得的5’序列和已知的EST 序列进行拼接，并通过ORF 软件分析，获得的HbHEX1 长为1612 bp，含有873 bp 的阅读框，编码290 个氨基酸，该序列上游有起始密码子ATG，下游有终止密码子TAG。此外还有292 bp 的5’-UTR和447 bp 的3’-UTR。根据拼接好的序列设计引物对HbHEX1 编码区进行扩增，得到一条约870 bp 左右的特异带，序列测定结果与拼接结果序列完全一致。
2.2 HbHEX1 编码的蛋白质特性分析
NCBI 的核酸、蛋白质结构特征在线分析工具对推导的HbHEX1 氨基酸序列进行分析，HbHEX1 编码的蛋白质由290 个氨基酸组成，分子量为33.02KD，等电点为6.35，含有保守的homomeodomain。该氨基酸序列与蓖麻、马铃薯、麻胡萝卜的同源异型盒蛋白的同源性分别为92％、77％和72％。进化树分析表明HbHEX1 属于HD-ZIP 类。
2.3 HbHEX1 的组织特异性表达
为了研究 HbHEX1 基因在巴西橡胶树不同组织的表达情况，分别提取橡胶树的花、愈伤组织、体细胞胚、叶、芽、胶乳的总RNA，反转录为cDNA，以actin 作为内参，进行RT-PCR 半定量分析。结果表明HbHEX1 基因在花和愈伤组织中基本上没有表达，在体细胞胚、芽、叶、胶乳和树皮中有表达，其中在胶乳中表达最高。
3 讨论
同源异型盒蛋白是一类重要的转录因子，广泛存在于真核生物体内，根据同源异型盒的特点，可以将同源异型盒蛋白分成不同的类型[1]。其中同源异型－亮氨酸拉链 （HD-ZIP）蛋白是属于同源异型盒蛋白家族中为植物所特有的一类转录因子，它包含一个高度保守的同源异型结构域HD，HD 羧基末端紧密连接着一个亮氨酸拉链（LZ）结构域。通过LZ 结构域的相互作用，HD-ZIP 蛋白以二聚体的形式与靶DNA 结合[15]。HD-ZIP 蛋白在植物发育过程中的作用非常广泛，如维管发育、器官形成、分生组织的维持、逆境应答等[7-16]。到目前为止，还未见到橡胶树同源异型盒蛋白基因的相关报道。本研究克隆到的橡胶树同源异型盒蛋白基因HbHEX1，它属于植物中特有的HD-ZIP。巴西橡胶树的乳管是天然橡胶生物合成和贮存的细胞，是决定橡胶产量最重要的结构。先前的研究表明在胶乳中高度表达的基因可能参与天然橡胶的合成与调控[19，20]。HbHEX1 在橡胶树的花、愈伤组织中基本没有表达，在体细胞胚、叶、芽、胶乳中均有表达，但在胶乳中表达量最高，这是否暗示HbHEX1 在巴西橡胶树特异组织乳管中起着重要的作用，我们将对该基因的功能做进一步的研究。参考文献
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