Foxc2在C57BL 6J小鼠腭胚突组织中的时空表达规律探讨

　　1 材料与方法

　　1.1 实验对象
　　选取C57BL/6J 纯系健康成年小鼠30 只，雌、雄比例为2：1(由四川大学华西基础动物实验室提供)。每日晚6 点将2 只雌性小鼠与1 只雄性小鼠合笼，次日晨8 点将雌、雄小鼠分笼，并检查雌鼠阴道阴栓形成情况，有阴栓形成的雌鼠做好标记单笼饲养，并开始记录妊娠天数，以发现阴栓形成当日计为embryo 0.5（E0.5）。当孕鼠妊娠到E12.5——E16.5 天时，分别取不同孕日孕鼠断头处死，立即剖宫取出小鼠胚胎头颅组织，置于4%多聚甲醛固定液中浸泡过夜。固定后组织脱水处理，石蜡包埋。一共获得126 个头颅组织蜡块，分别以冠状位、矢状位、水平位三个方向进行组织切片，切片厚度6um。

　　1.2 主要试剂
　　Foxc2 抗体购于英国Abcam 生物公司，SP 实验试剂盒与DAB 染色剂购于北京中杉金桥生物公司。

　　1.3 实验方法
　　严格按照SP 试剂盒说明书进行免疫组化染色实验，采用Abcam 生物公司提供的已被证实的前列腺癌组织片作为阳性对照，阴性对照采用PBS 液代替一抗，并与实验组切片在同一条件下同时进行DAB 显示剂染色。

　　1.4 结果判断
　　采用美国Image－Pro Plus（IPP）图像处理分析软件进行图像分析，以胞核着色呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。低倍镜（10×10）下，冠状位以两侧鼻腔外侧壁为界；矢状位前至鼻窦前缘，后至软腭后缘为界；水平位上至鼻窦后壁，下至软腭后缘为界，在上述范围内随机选取10 个区域，高倍镜（40×10）下观察1000 个组织细胞，计算阳性细胞所占的百分比为阳性指数(positive index，PI)。PI 按数值可分为4 个等级，<5％为I 级；5％～20％为II 级；2l％～40％为III 级；>40％为IV 级。I、II 级视为低表达，III、IV 视为高表达。

　　1.5 统计分析
　　数据处理应用SPSS 16.0 软件进行统计分析，不同组间PI 数值的比较采用t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MEP 组织HE 染色结果
　　在光镜下观察126 例MEP 组织，发现随着胎鼠的发育，腭突从舌体两侧逐渐上抬到舌体上方呈水平相对生长，随后腭突相互接触，上皮融合形成完整的腭器官。
　　E12.5 天，舌体较高，几乎与鼻中隔相连，腭突沿舌体两侧垂直向下生长，腭突在舌的两侧，尚未上抬；E13.5 天，舌体逐渐下降，两侧腭突逐渐抬起并向水平方向生长；E14.5 天，两侧腭突开始接触，并与上方鼻中隔接触，上皮融合，腭胚突间充质细胞相互交杂； E15.5天，两侧腭突融合基本结束，腭胚突间充质细胞开始向成骨细胞分化，腭骨支架开始形成；E16.5 天，腭骨支架发育基本成熟。
　　在腭发育早期（即腭突垂直生长期），腭中嵴上皮细胞（medial epithelium cell，MEE）尚不典型，呈扁平状，核仁小，胞浆不明显，细胞为多层不规则排列；腭胚突间充质细胞（embryonic palatal mesenchyme cell，EPM）则呈卵圆形，核仁较小，胞浆少，数量不多。
　　在腭发育中期（即腭突上抬及水平向生长期），MEE 细胞呈典型的两层排列，基底层为立方上皮细胞，表层为扁平上皮细胞，核仁较发育早期时稍大，胞浆较少；EPM 细胞呈卵圆形，核仁大，胞浆丰富，数量增多。在腭发育晚期（即腭接触融合期和分化成熟期），MEE 细胞分化开始出现差异，表层MEE 细胞开始凋亡并逐渐脱落，基底层MEE 细胞暴露，部分MEE细胞向口腔样或鼻腔样上皮转化。EPM 细胞则向成骨细胞分化，呈圆形，核仁大，多核细胞出现，胞浆嗜苏木素染色。

　　2.2 Foxc2 在MEP 组织的表达
　　Foxc2 在126 例MEP 组织中均有不同程度的表达，表达率为100%。阳性产物定位于间充质细胞的胞核中，呈棕黄色，处于不同细胞周期的胞核染色强度可有不同，而在上皮细胞中则并未发现有阳性细胞出现。间充质的阳性细胞在MEP 组织中大多呈弥散性分布。

　　2.3 Foxc2 与组织生长发育的时间表达规律
　　实验结果显示 Foxc2 表达与MEP 组织的生长发育呈正相关，在鼠胚发育早期即发现有Foxc2 表达于原发腭，此后随着腭的进一步发育，两侧腭突在中线融合，Foxc2 在腭中份以及腭侧翼处表达强烈，染色变深，阳性细胞数量增多。随着腭发育的成熟，Foxc2 表达逐渐减少，染色变浅，阳性细胞数量减少。其时间表达规律为：E12.5 天，Foxc2 主要集中在腭胚突根部组织表达，阳色染色较浅，呈淡黄色，阳性细胞数量不多；E13.5 天，Foxc2 开始在腭突体部出现表达，阳色染色开始变深，呈棕黄色，阳性细胞数量开始增多；E14.5 天，Foxc2 在整个腭突组织均有表达，阳性细胞数量明显增多，染色较深，呈深棕黄色； E15.5天，Foxc2 围绕着腭骨支架表达，阳性细胞数量开始减少，但染色仍然较深，呈深棕黄色，部分阳性细胞呈褐色；E16.5 天，阳性细胞基本消失，只有散在的阳性细胞存在，且染色变浅，呈淡黄色。计算Foxc2 在MEP 组织的阳性表达率可发现，随着胎龄的增加，鼠胚逐渐发育，MEP 组织逐渐发育成熟，Foxc2 的阳性表达率亦逐渐增高。当MEP 组织发育到成熟高峰期时，Foxc2 的表达量亦同时达到高峰。此后，MEP 组织步入成熟后期，Foxc2 表达量开始下降。

　　2.4 Foxc2 的空间表达规律
　　在实验中我们分别以冠状位、矢状位、水平位三个方向进行组织切片染色，结果显示Foxc2 在同一时间段的不同组织切片方向的表达量无明显差异。我们再将同一方向的组织按三等分部位进行比较，发现在同一时间段同一方向的不同组织部位的表达量仍无明显差异。其空间表达规律为：在冠状位的左1/3 部分，Foxc2 主要集中在腭突根部与眼球组织处表达；在中1/3 部分，则集中在鼻中隔区和舌体组织处表达；在右1/3 部分，则与左1/3 部分相同，亦是主要集中在腭突根部与眼球组织处表达。在矢状位的前1/3 部分，Foxc2可见在牙胚、鼻前份、前腭突等处表达；在中1/3 部分，则主要集中在腭板的间充质组织处表达；在后1/3 部分，则集中在腭板后缘与眼球组织处表达。在水平位的前1/3 部分，Foxc2可见在鼻中隔、前腭突、眼球组织处表达；在中1/3 部分，Foxc2 则集中在腭板的间充质组织处表达，尤其以腭中缝处表达强烈；在后1/3 部分，则可见在腭板后缘与脑组织边缘处表达。

　　3 讨论

　　小鼠胚胎腭的发育过程包括腭发生前期、腭突发生期、垂直生长期、腭突上抬及水平生长期、接触融合期、分化成熟期等阶段，其中胚胎7～12d 为腭器官发生期，胚胎12～15d为腭发育形成期。胚胎腭的发生发育期是腭器官的形成时期，也是致畸药物作用的敏感时期。多年来，对腭裂的发生机制一直众说纷纭，但大部分学者都认为腭裂的产生主要体现在以下两个环节：一是在腭器官发育早期，由于腭突不能上抬或上抬延迟，最终使两侧腭突不能接触而产生腭裂，二是在腭器官发育晚期，两侧腭突尽管能够接触，但接触后不能融合或融合后再裂开而产生腭裂。前者与EPM 细胞的分化有关，后者主要是MEE 细胞分化异常的结果。
　　本次研究通过免疫组化SP 法检测Foxc2 在MEP 组织生长发育过程中的时空变化，发现Foxc2 与MEP 组织的生长发育呈正相关，随着胎龄的增加，Foxc2 的表达量亦同步增高，至MEP 组织发育成熟期而到达表达高峰期。同时，我们在实验中观察到，Foxc2 只表达于MEP 组织的间充质部分，且持续表达于腭部组织发育的全过程，而上皮部分却未见表达，提示Foxc2 与中胚层来源的腭突间充质组织发育有相关性。EPM 细胞是腭突组织的主要细胞成分，其发育与分化持续于整个胚胎腭的发育形成过程，参与腭部的骨组织、肌肉及血管的形成。EPM 细胞具有合成胶原蛋白、氨基多糖等细胞外基质的能力，这些分子的合成及分泌可引起腭突体积增大、上抬。当受到致畸因素作用后，EPM 细胞的发育、分化及合成细胞外基质的能力均受到抑制，导致腭突体积变小，上抬延迟，从而引起腭裂的发生。
　　本课题组在前期的研究实验过程中也发现，应用RNA 干扰技术使亚甲基四氢叶酸还原酶基因发生突变，可引起EPM 细胞的增殖速度减慢，从而可能导致先天性腭裂的发生。
　　本次实验结果提示，在MEP 组织生长发育过程中，Foxc2 对EPM 细胞的增殖、分化以及腭骨支架的形成、成熟可能具有重要作用。本次研究明确了Foxc2 在MEP 组织生长发育过程中的时空表达规律，但Foxc2 是如何影响MEP 组织的生长发育过程，具体是通过什么途径来发挥作用的，还有待进一步的研究。