TGF-β1诱导下人肝星状细胞糖蛋白糖谱的研究
0 引言肝纤维化(hepatic fibrogenesis)是指肝脏内弥漫性细胞外基质，特别是胶原过度沉积。我国每年有许多急性肝炎和肝炎病毒携带者发展为慢性肝炎，最终发展为肝硬化。肝纤维化是慢性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，而此阶段是个可逆过程，如能及早发现肝纤维化，并及时加以控制，则可以有效阻断肝硬化的病情进展。
肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell ,HSCs）的活化与增值是肝纤维化形成的中心环节[1,2]。1876 年德国人Von Kupffer 首次描述了星形细胞。在正常肝脏中，肝星状细胞与肝细胞之比为1：20，其总体积占肝体积的1.4%。HSCs 的激活过程可人为地分为两个阶段:启动阶段及持续激活阶段,相应的HSCs 也经历三种形态转化:静止HSCs→“移行细胞”( Transitional cell)→肌成纤维细胞样细胞(Myofibroblastic – like cell,MFLC) [3]。
转化生长因子- β1（transformation growth factor-β1 ，TGF-β1）在肝纤维化疾病发生、发展中起重要作用,被认为是最重要的致纤维化因子[4]。TGF-β1 属于转录生长因子家族之一。这个家族的细胞因子影响的范围广泛，包括细胞分化，细胞增殖，细胞凋亡和迁移。TGF-β1参与包括肝脏在内的很多器官纤维化的启始和维持。因此，在发生了纤维化的组织和血清中可观测到有活性TGF-β1 量的增加，在转基因小鼠体内TGF-β1 过表达，同时，外源TGF-β1也被证实诱导器官纤维化[5,6]。
目前针对HSCs 的研究多在基因层面，糖谱的研究很少涉及。因此有必要开展对HSCs中糖蛋白糖链的规模化分析研究，通过比较“静态”HSCs 和经TGF-β1 诱导活化的HSCs 糖蛋白糖谱表达差异，寻找肝纤维化相关糖蛋白，分析糖蛋白糖链与肝纤维化的关系，研究肝纤维化过程中蛋白糖基化修饰的变化。
本实验以人肝星状细胞系LX-2 为模型，采取终浓度为2ng/mL 的TGF-β1 诱导LX-2 细胞，并通过半定量RT-PCR 验证其纤维化；利用凝集素芯片技术对“静态”LX-2 细胞与经TGF-β1 诱导发生纤维化的LX-2 细胞糖蛋白糖谱进行分析；研究发现在发生纤维化的LX-2细胞中T 抗原/Tn 抗原结构增多，且有明显的唾液酸化。另外，发生纤维化的LX-2 细胞中N-糖链分支结构显著增加。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
人肝星状细胞系（LX-2）由美国纽约西奈山医学院（(Mount Sinai School of Medicine)Scott L.Friedman 教授惠赠。高糖DMEM 购自美国GIBCO 公司，小牛血清购自北京民海生物公司，青霉素，链霉素均购自美国Amresco 公司，TGF-β1 购自美国Perprotech 公司，PCR引物由北京三博远志公司合成，cDNA 反转录试剂盒购自美国Invitrogen 公司， T-PER?动物组织蛋白提取试剂购自美国PIERCE 公司，Cy3 荧光染料购自美国Amerhsma 公司，Microcon YM-30 离心超滤器购自美国Millipore 公司。凝集素芯片（包含有37 种凝集素）由本实验室制备。CO2 培养箱购自美国Therme Forma 公司，Biometra PCR 仪购自德国耶拿公司，晶芯SmartArrayer48 点样仪购自北京博奥生物公司，生物芯片扫描仪4000B 购自美国Axon 公司。
1.2 细胞诱导
复苏后的LX-2 细胞以含体积分数10%小牛血清，1 ×105 U /L 青霉素及100mg/L 链霉素，PH7.35-7.45 的高糖DMEM 培 养液,于37 ℃, 饱和湿度，体积分数5% CO2 培养箱培养,当细胞处于对数生长期时,胰酶消化,培养液悬浮细胞。调整细胞密度为1 ×106 个mL - 1 ,接种于6 孔板中培养24 h, 再以0.5%小牛血清的高糖DMEM 培养液培养24h。将细胞分为对照组与实验组, 对照组以2%小牛血清的高糖DMEM培养液处理24h,实验组以加入终浓度为2ng/mL 的TGF-β1，体积分数为2%小牛血清的高糖DMEM 培养液处理24h。每组三个重复孔。本实验TGF-β1 诱导剂量参看已报道文献[7]。
1.3 半定量 RT-PCR 技术
1.3.1 引物选择
本实验参考文献[8]，挑选了两个在纤维化肝星状细胞中高表达的基因，其引物序列为：TGF-β1（Sense 5’-GGCAGTGGTTGAGCCGTGGA-3’，Anti-sense 5’-TGTTGGACAGCTGCTCCACCT-3’ ） 和MMP-2 （ Sense 5’-GTATTTGATGGCATCGCTCA-3’ ， Anti-sense5’-CATTCCCTGCAAAGAACACA-3’）。（一）TGF-β1 是β转录生长因子家族的一员。这个家族成员均为多功能肽段，主要调节细胞增殖，分化，黏附，迁移。TGF-β1 促成成肌纤维样细胞转化，刺激细胞外基质蛋白合成，同时降解抑制因子。文献报道纤维化肝星状细胞中TGF-β1 mRNA 高表达[8]。（二） MMP-2 是基质金属蛋白酶家族蛋白。在正常生理机制，如胚胎发育，细胞繁殖，组织成型过程中负责降解细胞外基质。该基因编码的酶降解IV 型胶原蛋白。IV 型胶原蛋白是细胞外基质蛋白的主要组成部分。文献报道纤维化星状细胞中MMP-2 mRNA 表达量升高 [7,8]。同时选择β-Actin 做内参。
1.3.2 细胞总 RNA 提取
各用1mL Trizol 试剂裂解对照组和实验组贴壁细胞，反复吹打，直至细胞完全裂解于Trizol 试剂中，分别转入两个EP 管中，吹打至没有明显沉淀；加入200μL RNA 专用氯仿剧烈振荡，待成乳状无明显分层后冰上静置10min，4℃ 12000 r／min 离心15 min，取上清；在上清液中加入等体积异丙醇颠倒混匀，10-30℃静置10min，4℃ 12 000r／min 离心10 min，弃去上清；1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500 r／min 离心5min，弃去上清；加入30μL DEPC水，轻轻震荡溶解。
1.3.3 cDNA 单链合成
通过琼脂糖凝胶电泳验证实验组和对照组总RNA 完整性；对完整性良好的两组细胞各取50μg 总RNA，按照美国Invitrogen 公司cDNA 反转录试剂盒要求反转出单链cDNA；Microcon YM-30 离心超滤器纯化。
1.3.4 PCR 技术
半定量RT-PCR 使用TaqDNA 聚合酶，25μL PCR 扩增体系。此PCR 反应条件参照文献[8]。分别以对照组和实验组单链cDNA 为模板，以上述TGF-β1 和MMP-2 序列分别为引物，采用的PCR 反应条件为：TGF-β1：94℃变性45s，60℃复性45s，72℃延伸1min，40个循环；MMP-2：94℃变性45s，58℃复性45s，72℃延伸1min，35 个循环。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分离。
1.4 凝集素芯片
1.4.1 总蛋白提取
将蛋白酶抑制剂按10μL/mL 加入1-2mL T-PER?试剂中，取适量T-PER?试剂与蛋白酶抑制剂混合液分别沿对照组和实验组培养瓶细胞贴壁面加入；充分吹打，裂解细胞（注：冰上操作，防止蛋白降解）；将溶液转入1.5mLEP 管中冰上静置10min，4℃ 10000g 离心5min，吸取上清做下游分析；用BCA 法给蛋白定量。
1.4.2 荧光标记
各取100μL 对照组和实验组总蛋白分别与100μLNa2CO3 混匀，将混合液与Cy3 荧光染料孵育标记，Sephadex G-25 柱分离纯化Cy3 标记蛋白。收取标记后蛋白，测定偶联荧光蛋白浓度。
1.4.3 凝集素芯片孵育
将凝集素芯片浸泡于封闭缓冲液中，25℃温浴1h，取出用10 mmol/L PBST，10 mmol/LPBS 各洗2min，甩干；取等量标记后LX-2 细胞系对照组和实验组蛋白液，分别于孵育缓冲液混匀成700μL 混合液，在冰上孵育30min 后覆盖点样区，加盖玻片常温孵育3h，结束后，分别用1×PBST，1×PBS 各洗2 次，每次2min，甩干；GenPix 4000B 芯片扫描仪扫描芯片，光电倍增管PMT 设为100%。用GenePix 3.0 软件从扫描结果图中获取荧光信号强度值和背景值等信息进行分析。运用HCE3.0 软件对数据进行聚类分析，筛选表达差异最为明显的糖蛋白。
2 结果
2.1 半定量 RT-PCR 验证
从半定量RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳结果看，经TGF-β1 诱导的LX-2 细胞中TGF-β1和 MMP-2 表达量较之对照组细胞都有所提高。证明经TGF-β1 诱导LX-2 细胞系确实发生了纤维化变化，验证了本实验采用的细胞诱导方法可行。此种方法培养的细胞可进行下一步实验操作。
2.2 凝集素芯片
用GenePix3.0 软件扫描芯片，获得对照组和实验组凝集素芯片上每个点的荧光信号值，每点9 个重复，这样获得9 个数据，抽取中值进行归一化处理。从图中可看出，在对照组细胞中GNA 与其糖蛋白有最大结合，而在实验组细胞中AAL 与其糖蛋白有最大结合。
2.3 聚类分析
运用HCE3.0 软件对对照组和实验组多列数据先进行归一化处理，然后聚类分析。绿色表示与各个凝集素结合力弱，红色表示与各个凝集素结合力强，黑色表示与各个凝集素结合力介于前两者之间。从图可看出在实验组凝集素芯片上PHA-E、SJA、AAL、ECA 等结合力明显强于对照组芯片，同时PSA、MAL-II、GNA 等明显弱于对照组芯片。
利用HCE3.0 软件还可生成曲线图。由图中看，从对照组到实验组的连线倾斜度越大代表荧光信号差异越大，红色代表荧光信号强，绿色代表荧光信号弱。一条与基线基本平行的直线意味着无差异。有图可见，两组糖蛋白糖谱相比较，显示差异较大的凝集素相对较少，多数凝集素有较小差异。
2.4 糖谱差异分析
对照组与实验组数据经归一化处理后，作出其对应Ratio 值。依据表中数据进一步分析：（1）Ratio 值大于2 视为表达升高。PHA-E 对应Ratio 值最大，可达23，说明其对应糖链表达升高最显著。PHA-E 特异性识别糖链为二分型GlcNAc 和二天线N-糖链，说明在肝纤维化的LX-2 细胞中二分型GlcNAc 和二天线N-糖链结构大量增加。（2）Ratio 值小于0.5 则视为表达降低。PSA 对应Ratio 值最小，说明其对应糖链表达降低最显著。PSA 特异性识别糖链结构为Fucoseα-1,6GlcNAc(core fucose)，说明在纤维化LX-2细胞中核心岩藻糖结构Fucoseα-1,6GlcNAc 方式大量减少。
3 讨论
本研究利用凝集素芯片分析“静态”LX-2 细胞系和经TGF-β1 诱导LX-2 细胞系糖蛋白糖谱表达差异，发现了一系列肝纤维化疾病相关糖蛋白。
研究发现发生纤维化的肝星状细胞中GalNAcα-Ser/Thr(Tn)结构（DBA、VVA、MPL）表达增高，GalNAcα- Ser/Thr(T)结构，Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T)结构（PNA、ACA）表达也增高。T 抗原/ Tn 抗原是肿瘤细胞表面特有的黏蛋白相关的一种糖抗原标记。T 抗原/ Tn抗原的表达改变在胃食管癌和乳腺癌报道较多，目前在肝癌也有发现[9]，而本实验在纤维化的肝星状细胞中也发现T 抗原/ Tn 抗原表达增高。另外，T 抗原或Tn 抗原表达改变还体现在T 抗原或Tn 抗原唾液酸化而形成sialy-T，sialy-Tn，甚至disialyl-T 抗原。目前已发现在纤维化的肝星状细胞中St3gal 和ST6GalNAc 基因表达上调，该基因对应的酶催化合成sialyl-T 抗原及Sialyl-Tn 抗原。
在表达升高的凝集素中，升高最明显的为PHA-E。本研究发现在纤维化的肝星状细胞中糖蛋白N-糖链分支结构增加，表现为是平分型GlcNAc 结构及二天线N-糖链（PHA-E、PHA-E+L）结构增加。已有大量研究证明，糖链的变化与肝癌的发生发展密切相关，其中最常见的如N- 糖链分支的增加，肿瘤细胞中增加的N- 糖链分支主要是β1-6 分支。β1-6 分支结构的增加是由生成这一结构的糖基转移酶N-acetylglucosaminyl-transferases-V(Mgat5)的表达量或是活性增加所致[10]。另外有研究表明，Mgat5 酶活性的增加与癌基因v-src、T24-H-ras 等的表达相关，这些癌基因的下游通路，尤其是Ras-Raf-Ets 信号通路能够上调Mgat5 基因的转录[11,12]。本实验中N-糖链分支结构的增加可能也与此有关。
本研究还发现，发生纤维化的肝星状细胞中核心岩藻糖Fucoseα-1,6GlcNAc(corefucose)，α-L-Fuc 结构增加。FUT8 指导Fucoseα-1,6GlcNAc 合成。2007 年Samuele De Minicis等人对纤维化的HSCs 进行基因芯片检测，结果显示Fuca1 基因在活化的HSCs 中表达上调。
Fuca1 为岩藻糖苷酶，主要水解Fucoseα-1,6GlcNAc(core fucose)糖苷键。推测纤维化的LX-2细胞中Fucoseα-1,6GlcNAc 结构在FUT8 催化下大量合成，诱使Fucα1 高表达以降解Fucoseα-1,6GlcNAc 结构。α1-6 岩藻糖增加是肝癌发生转移的重要糖基化改变之一。早在1996年起α1-6 岩藻糖增加就已经应用于肝癌的早期诊断，并且预示着病人具有更高的转移可能性[13,14]。肝癌α1-6 岩藻糖结构的增加主要是由糖基转移酶Fut8 的表达量或是活性的增高引起，近年也有报道GDP- 岩藻糖转运子(GDP-fuctransporter)是导致肝癌中岩藻糖表达增加的关键分子[15]。
研究还发现在纤维化的肝星状细胞中Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc)结构（MAL-Ⅱ）表达减少，而 Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc)结构（SNA）表达增加。已有文献报道[18], St6gal1（编码β-半乳糖苷α2-6 唾液酸转移酶）基因在纤维化肝星状细胞中表达上调。这与本实验结果相吻合。
另外，本研究发现，在纤维化的肝星状细胞中Galβ-1,4GlcNAc 结构（ECA、SNA）增加，α- 甘露糖结构（ConA、LCA）增加，(GlcNAc）n 增加。有研究表明，α- 甘露糖结构的增加可能和肿瘤的恶性表型相关．在人肝癌和大鼠肝癌的GGT 都曾报道出现增多的甘露糖结构修饰，而ConA 包被的红细胞也只能结合恶性肿瘤上皮细胞，不结合正常细胞[19]。
在Douglas’s 组和Bramwell 组的报道中，一种分子质量为105 ku 的WGA 结合糖蛋白家族在正常细胞中表达，而在癌症细胞中消失．另一种异常的和肿瘤恶性相关的100 ku 的膜糖蛋白和WGA 结合减弱，但和ConA 结合增强[20,21]。
凝集素芯片是一种糖捕获芯片，可用于迅速获悉糖蛋白不同的糖基化特征，可以快速、高通量地获得糖蛋白聚糖结构信息[22]。目前已发现多种癌症细胞内糖谱变化，也已找出部分癌症相关糖蛋白标记物，本研究通过凝集素芯片技术也找出肝纤维化疾病相关糖蛋白标记物。但由于凝集素与聚糖链结合重叠性，加之目前凝集素所能亲和识别的糖链信息仍有限，凝集素芯片技术还需与其他技术，如糖芯片技术，基因芯片技术，质谱技术等联合使用，并与生物信息学，统计学，遗传学，细胞生物学等学科相辅相成。
4 结论
本文给出了“静态”人肝星状细胞系LX-2 与经TGF-β1 诱导纤维化的LX-2 细胞系糖蛋白糖谱，分析出一系列肝纤维化疾病相关糖蛋白糖链。根据分析讨论发现，人肝星状细胞系纤维化的糖蛋白糖谱表达差异，部分类似于肝癌糖谱特征，可推测在肝纤维化阶段肝脏已具备了某些癌症早期表现，如能及时治疗可防止癌症发生。同时，本研究也为研究癌症的发生机制提供了糖组学理论支持。
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