雏鸡黏膜组织抗体生成细胞中E.necatrix的影响

　　鸡球虫病是严重危害养鸡业的全球性重要寄生虫疫病之一，深入探索球虫病免疫发生机制是防治该病的关键，综合国内外已有研究资料，对球虫生活史、流行病学、抗原组分和疫苗研制等较多，并取得了一定成效，而对球虫感染雏鸡，特别是E.necatrix 感染雏鸡后，其消化道和呼吸道局部黏膜组织体液免疫功能的变化，尚未见报道。本项目通过对E.necatrix 感染雏鸡哈德尔腺、盲肠扁桃体中IgA、IgM、IgG 生成细胞数量动态变化的检测，探讨E.necatrix 感染对雏鸡黏膜组织体液免疫功能的影响，为进一步研究鸡球虫病免疫防治，特别是研发黏膜疫苗提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料
　　1.1.1 球虫
　　毒害艾美球虫(Eimeria.necatrix, E.necatrix)强毒株，中国农业大学动物医学院寄生虫教研室惠赠。
　　1.1.2 实验动物
　　1 日龄健康艾维茵2000 肉用商品混合雏鸡120 只，购自哈尔滨某孵化场，在无球虫环境中饲养至14 日龄。
　　1.1.3 主要试剂
　　兔抗鸡 IgA、IgM、IgG 血清(RACIgS)，本研究室制备；过氧化物酶标记羊抗兔IgG(HRP-SARIgG)结合物，北京鼎国生物技术有限公司产品；APES 武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 实验方法
　　1.2.1 实验设计及动物处理
　　120 只肉雏鸡随机分为：球虫感染组（N 组）和未感染球虫的对照组（C 组）。其中，N组雏鸡于15 日龄经口感染8×103 个/只感染性球虫卵囊；C 组雏鸡未感染球虫为对照雏鸡。两组雏鸡严格隔离，相同条件下饲喂无抗球虫药的肉用雏鸡全价饲料饲养管理。
　　1.2.2 实验材料采取
　　分别于雏鸡感染球虫卵囊后0、2、4、7、10、14、16、18、21、24 和28 天随机抽取相同数量雏鸡心脏采血处死后，快速采取哈德尔腺、盲肠扁桃体经甲醛缓冲液固定、乙醇脱水、石蜡包埋等处理后，低温保存供抗体生成细胞数量检测用。
　　1.2.3 检测指标及方法
　　IgA、IgM、IgG 生成细胞数量测定采用石蜡组织切片及免疫酶组织化学染色法。应用Timo Romppanen 格点计数法于100×10 倍光镜下随机检测被检组织相应部位单位面积上的阳性细胞数。

　　1.3 数据处理
　　采用Minitab 软件进行数据处理，比较分析组间差异性。

　2 结果

　　2.1 E.necatrix 初次感染雏鸡盲肠扁桃体弥散区抗体生成细胞动态变化
　　14 日龄肉雏鸡初次感染毒害艾美球虫后，其盲肠扁桃体弥散区IgA、IgM、IgG 生成细胞数量分别于感染后4～21d、7～21d、10～18d 较对照雏鸡明显升高（P<0.05 或P<0.01），于16d 达峰值。

　　2.2 E.necatrix 初次感染雏鸡盲肠扁桃体淋巴小结抗体生成细胞动态变化
　　肉雏鸡初次感染毒害艾美球虫后，其盲肠扁桃体淋巴小结的IgA、IgM 和IgG 生成细胞数量分别于感染后7～21d 和10～21d 较对照雏鸡明显增加（P<0.05 或P<0.01）。其中IgA生成细胞数量于感染后16d 达最高值；IgM、IgG 生成细胞数量均于感染后14d 达峰值。
　　雏鸡初次感染毒害艾美球虫后，其哈德尔腺集合管周围IgA 和IgM、IgG 生成细胞数量于感染后10～21d 和7～21d 明显高于对照雏鸡（P<0.05 或P<0.01）；IgA、IgM 生成细胞数量均于感染后16d 达最大值；IgG 生成细胞数量于感染后14d 达高峰。

　　2.4 E.necatrix 初次感染雏鸡哈德尔腺分泌管抗体生成细胞数量的动态变化
　　雏鸡初次感染毒害艾美球虫后哈德尔腺分泌管周围IgA 和IgM 生成细胞数量均于感染后7～21d 明显高于对照雏鸡（P<0.05 或P<0.01），14d 达峰值；IgG 生成细胞数量于感染后10～21d 较对照雏鸡明显升高（P<0.05 或P<0.01），16d 达峰值。

　　3 讨论

　　黏膜免疫系统构成动物机体抵抗病原微生物入侵的第一道天然屏障，局部抗原刺激更能有效激发黏膜组织分泌大量分泌型免疫球蛋白A (sIgA)。后者在机体抗感染防御中发挥十分重要的作用，故其越来越受到广大学者的高度关注。已成为医学界和动物医学界研究的热点之一。本项研究发现，肉雏鸡初次感染E.necatrix 后，其盲肠扁桃体和哈德尔腺的IgA、IgM、IgG 生成细胞分别于感染后一定时期内较未感染的对照雏鸡显著增加。表明E.necatrix初次感染肉雏鸡消化道和呼吸道局部黏膜组织的体液免疫功能明显增强，免疫球蛋白生成细胞数量增多，其生物合成特异抗体功能增强，结果局部体液（如肠液、泪液等）的IgA、IgM、IgG 含量相应增多，最终引起全身体液免疫功能增强。该结果与本项目的另一部研究结果基本一致。
　　Girard 等检测了E.acervulina 或E.tenella 感染鸡十二指肠和盲肠培养物上清液中特异抗体IgG、IgM 和IgA 水平的动态变化。其结果发现E.acervulina 感染雏鸡后1 周，十二指肠和盲肠中可检测到IgM；2 周IgG、IgM 和IgA 含量均显著提高；E.tenella 感染雏鸡后1~2周，十二指肠和盲肠中有高水平的IgG、IgM，但2 周后只在盲肠中检测到IgA。表明球虫寄生部位产生的特异抗体明显高于非寄生部位。
　　郑明学等研究发现，E.tenella 感染鸡后2～3 天，盲肠扁桃体IgG 生成细胞开始增殖，9～12d 达峰值，以后开始缓慢下降，22d 时仍然高于对照雏鸡。本研究发现，雏鸡初次感染E.necatrix 后，其盲肠扁桃体中IgG 生成细胞数量增殖及达峰值时间与郑明学报道不完全一致。产生该差异的原因可能与球虫虫种、感染剂量等不同有关，因为只有E.necatrix入侵机体后在两个部位进行生殖——即其第一代和第二代裂体生殖发生在小肠；第三代裂体生殖转移至盲肠上皮细胞，并进行有性生殖，形成卵囊。E.necatrix 感染后排卵期也较其他种球虫长，即E.necatrix 可能在机体内存在较长时间，因而推测其所诱导的保护性免疫反应可能也会持续较长时间。另外，E.necatrix 免疫原性亦很弱，上述诸多因素可能是引起抗体生成细胞分泌时相滞后的主要原因。综上可见，虽然局部黏膜的体液免疫在抗球虫免疫中同样发挥着不可忽视的重要作用，必须指出，体液免疫对抗球虫感染，其范围依然有限，只有与细胞免疫协同作用才能完全发挥功效。