小研制备鱼藤根中两种鱼类化合物

　　鱼藤属（Derris Lour）豆科植物，全世界有80 余种，主要分布于热带及亚热带地区，中国约20 种，如毛鱼藤、毒鱼藤、中南鱼藤等。鱼藤属、灰叶属植物中均含大量鱼藤酮类化合物，如鱼藤属植物毒鱼藤、毛鱼藤的根、茎部位以及灰叶属植物西非灰毛豆的叶尖部位均富含大量鱼藤素和鱼藤酮。鱼藤素和鱼藤酮分子结构所示。
　　鱼藤素是一种黄酮类化合物，鱼藤素具有昆虫毒杀、拒食、生长发育抑制等活性。鱼藤素具有很强的抗肿瘤作用，在纳摩尔水平可以抑制多种肿瘤细胞的生长。鱼藤素可以显著抑制结肠癌细胞系HT-29 的生长，可以诱导人的前恶性和恶性支气管上皮细胞凋亡，而对人正常的细胞没有杀伤作用[1~2]。已发现其在体内外有化疗活性其活性是通过抑制NADH 即泛素氧化还原酶活性，调节细胞周期而诱导凋亡[3]；鱼藤素可有效抑制癌细胞的生长繁殖并杀灭癌细胞，对肺癌细胞增殖的抑制效果较为显著[4~5]。
　　鱼藤酮(mtenone)是一种天然杀虫剂和杀螨剂，主要从热带和亚热带的鱼藤属(Derris)、尖荚豆属(Lonchocarpus)和灰叶属(Tephrosia)植物中提取，是鱼藤根中的主要有效杀虫成分，具有杀虫谱广、不污染环境和不易产生耐药性等特点，为无公害农产品生产推荐使用品种，近年来被作为一种大力发展的新型的低毒农药有着很好的应用前景[6~7]。
　　高速逆流色谱(HSCCC)是一种液一液分配新型色谱技术，它完全使用液体溶剂作为固定相，可在短时间内实现样品的高效分离和制备，与传统柱层析法相比，它具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点。由于不使用固相载体作固定相，不仅费用低，还避免了固相载体带来的样品预处理要求高、因不可逆吸附而引起的样品损失、失活变性等，因此可以达到高效分离。目前此项技术正被逐渐应用于生化、生物工程、医药、天然产物、有机合成、地质及材料等领域。
　　本研究探讨了应用HSCCC 分离技术从鱼藤根粗提物中快速高效地同时分离纯化2 种高纯度的单体化合物的方法。
　　1 实验部分
　　1.1 材料及仪器
　　鱼藤根采于福建闽清，经福建农林大学吴德峰教授鉴定。高速逆流色谱分离实验中所用正己烷、乙酸乙酯、甲醇等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为自制蒸馏水；高效液相色谱(HPLC)分析实验中所用乙腈为色谱纯(默克公司)，水为娃哈哈纯净水，三氟乙酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。用水和三氟乙酸配制0.1％三氟乙酸溶液。
　　1.2 仪器
　　TBE-300B 高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)，包括TBP-50A 泵，TBD-23 UV紫外检测器(254nm)，BF-2002 CT11 信号采集单元，HW2000 工作站；Waters 600E 高效液相色谱(HPLC)仪(美国Waters 公司)，包括600E 四元梯度泵，2996 光电二极管阵列(PDA)检测器，中文Empower 色谱管理系统，四通道脱气机等。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 粗提物的制备
　　取鱼藤根洗净烘干，将已干燥的鱼藤根粉碎过60 目筛后超微粉碎过300 目筛；取12.0g鱼藤根粉末，加入240ml 氯仿超声波处理后置于暗处震荡浸提24 小时后过滤，将滤渣重复浸提两次。合并滤液，将滤液移至离心管中于4℃，8000r/min 离心30 分钟后，浓缩提取液得浸膏。将浸膏分散于水中，混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取氯仿层萃取液蒸干，置于真空干燥箱50℃中完全干燥，得到黄色粉末。
　　1.3.2 高速逆流色谱两相溶剂系统的选择
　　以四元溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水不同配比配制两相溶剂系统，测定成分的分配系数k 及分离因子α，步骤如下:取大约20mg 样品放入试管中，加入已平衡的两相溶剂系统，上、下相溶剂各5mL，充分振摇溶解后暗处静置分层，分别取上、下相用HPLC 检测，在254nm 波长下记录上相和下相的峰面积，分别记为AU 和AL，计算出分配系数和分离因子：
　　分配系数K=AU/AL；分离因子α=K2/K1，（K2>K1）。
　　1.3.3 HSCCC 分离
　　按 V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶0.25∶5∶3 将所有溶剂加入分液漏斗中，充分振摇后静置24h 分相，以上相作为固定相，下相作为流动相，采取正向洗脱方式进行洗脱。将上下相超声脱气60min，先将固定相既上相以20mL／min 的流速灌满色谱分离柱，待有上相流出后缓慢调节高速逆流色谱仪的转速至850r/min，以流速2ml/min 泵入流动相，设定波长254nm，温度25℃。待基线平稳后进样和采集数据，进样量为50.0mg，根据色谱图手动收集各色谱峰组分。
　　1.3.4 高效液相色谱分析测定
　　采用 HPLC 检测粗提物的成分及经HSCCC 分离后各色谱峰的纯度。色谱条件：WatersSymmetry C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)、流动相为A（乙腈）和B（0.1%三氟乙酸）混合梯度洗脱：0-8minA（55%-65%）；8-11minA（65%-70%）；11-15minA（70%-90%）。
　　流速为1mL/min、柱温为25.0℃，进样量为10μL。
　　2 结果与讨论
　　2.1 高速逆流色谱分离条件的优化
　　溶剂系统是决定高速逆流色谱分离样品效果的最重要因素。不同的溶剂系统由于粘度、极性、密度等性质的差异，对相同的成分会产生不同的溶解、分配能力，形成分配系数的差异。根据色谱理论，利用HSCCC 分离样品的必要条件是样品在两相中的分配系数必须在0.5和2.0 之间，最好是1，若K<<1，样品很快随流动相流出，达不到分离效果；若K>>1，样品出峰时间拉长，形成宽峰。由于CCC 的理论塔板数在800 左右，因此要得到高的分离度，样品各组分间的分离因子α(各组分的K 值之比)应大于1.5。可用高效液相色谱法和薄层色谱法等测定[8]。本研究采用HPLC 测定，共考察了6 个溶剂系统，结果见表1。体系中在甲醇和水的比例不变的情况下，增加正己烷的比例或减少乙酸乙酯的比例可以使样品在体系中体系具有合适的的分配系数，体系Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ虽然具有很好的分配系数但是目的产品B 和C 两者分离因子均小于1.5，所以应予排除，只有体系Ⅳ不但有合适的分配系数，其目标产品的分离因子α也大于1.5，因此可以将B 和C 分离开来。
　　本实验最终选择了V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水) = 7∶0.25∶5∶3，利用此体系分离样品，各化合物分配系数及分离因子合理，分离效果好。
　　2.2 HSCCC 分离结果
　　采用采用“1.3.3”节的条件对鱼藤根粗提物进行HSCCC 分离，分离时间为2.5 小时，固定相保留率为71%，由图2 可见，在本实验条件下经HSCCC 分离纯化后，得到4 个较明显的峰。
　　2.3 样品的HPLC 色谱分析
　　采用“1.3.4”节的条件，对鱼藤根粗提物进行检测分析，所得的HPLC 图谱见图4，图谱中主要出现三个主要峰，经检测第一个峰为杂质峰，第二个和第三个峰分别为为化合物B，化合物C。经鉴定分别为鱼藤酮和鱼藤素[9]。
　　2.4 分离产物的纯度检验
　　采用“1.3.4”节的条件，对鱼藤根粗提物的HSCCC 分离产物进行HPLC 检测分析后两个峰较纯分别为鱼藤酮，鱼藤素，结果见图5，图6.使用面积归一法测定所得的各组分纯度，分别为：鱼藤酮：96.60%，鱼藤素：97.87%。
　　3 结论
　　本实验首次采用V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水) = 7∶0.25∶5∶3 四元溶剂系统在2.5h 内从50.0mg 的鱼藤根粗提物中，分离纯化得到纯度为97.87%的鱼藤素23.4mg和纯度为96.60%的鱼藤酮6.4mg，取得了较好的结果。为实验室进行下一步的药理实验提供支持。与常规柱色谱方法比较，该法具有简便、快速、节省溶剂、产物纯度较高的特点，具有较好的实际应用价值。
　　该方法的开发对分离纯化天然植物资源中的活性化合物具有潜在的应用价值，并可为中草药质量控制所需要的高纯度化学对照品的制备提供一种实用的方法。