探讨野生余甘子中超氧化歧化酶SOD的提取工艺

　　余甘子(Fructus Phyllanthi)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)植物余甘子(Phyllanthus emblica L)的果实. 别名滇橄榄、久如拉(藏药)、麻项帮(傣药)、庵摩勒(古印度梵语)等[1], 我国的余甘子资源十分丰富，主产区分布在南方诸省(区)，其中以福建、云南两省的产量最多[2]。我国古代典籍《唐本草》[3]、《本草拾遗》及《本草纲目》[4]中对其药用价值均有论述。余甘子具多种保健作用，仅其抗菌、抗病毒降脂、降压、降糖、抗衰老、抗肿瘤等保健作用必将在保健食品的开发研究中大有作为[5,6]。余甘子又是富含超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 简称SOD)水果资源。SOD 是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的金属酶，是体内自由基主要清除剂之一，具有保护心脏、防止心血管疾病，抗衰老以及抗癌之功效。由于过去SOD 主要靠从动物血液中提取，而且工艺复杂，原材料分散不易保管，制备成本高，导致市场十分紧缺，并且由于“血液病”的影响，消费者对其极不放心。
　　因此，从余甘子中提取SOD，食用安全性高、资源丰富、价廉，具有广阔的开拓前景[7]。国内外还尚未有详细关于从余甘子中提取SOD 的研究报道，本文以野生余甘子为原料，深人研究了SOD 提取的工艺，得出最佳提取工艺参数，为余甘子SOD 的进一步深入研究提供理论依据。
　　1 实验仪器与试剂
　　1.1 原材料，试剂与仪器
　　余甘子新鲜果实（购买自攀枝花），0.1mol/L 磷酸钠缓冲液、蒸馏水、50mmol/L（PH8.2）Tris-Hcl、10mmol/L Hcl、6mmol/L 邻苯三酚、石英砂、硫酸铵（均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂），电子分析天平（上海天平仪器厂）研钵 ,UV-2201 型紫外分光光度计(日本岛津),高速离心机（飞鸽牌）不锈钢恒温水浴箱（北京中兴仪器有限公司），冰箱等.
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 SOD 的提取
　　余甘鲜果→拣选清洗→破碎→脱核→提取→离心分离→SOD 粗酶液。
　　1.2.2 抽提缓冲液的优化
　　分别配制不同pH 值的磷酸盐缓冲液(50mmol/L),pH 值分别为:7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0。取6 个研钵,分别称量6 份冷冻余甘子,每份为10 g,放入研钵中,分别加10 mL 不同pH值的磷酸盐缓冲液及少许石英砂,在冰盐浴的条件下充分研磨后,用高速冷冻离心机以12 000r/min 的离心条件下离心,去沉淀,留取上清液,然后取1 mL 溶液并稀释20 倍,用邻苯三酚自氧化法分别测定其酶活性。
　　1.2.3 缓冲液冲液体积的优化
　　取 5 个研钵,分别称量6 份冷冻余甘子,每份为10 g,放入研钵中,按体积/质量(v/g)分别加入5 mL(0.5 倍)、10 mL(1 倍)、15 mL(1.5 倍)、20 mL(2 倍)、25 mL(2.5 倍)的磷酸盐缓冲液及少许石英砂,在冰盐浴的条件下充分研磨后,用高速冷冻离心机在12 000 r/min 的离心条件下离心,去沉淀,留取上清液,然后取1 mL 溶液并稀释20 倍,用邻苯三酚自氧化法分别测定其酶活性。
　　1.2.4 正交试验设计
　　余甘子中 SOD 酶的提取采用3 因素3 水平进行正交试验。
　　1.2.5 SOD 的纯化
　　纯化条件的优化与筛选：用单因子实验法考察硫酸铵饱和度对SOD 粗酶纯化的影响[8]，筛选出最优化的纯化条件。
　　硫酸铵饱和度的选择：硫酸铵分级沉淀优化取8 个烧杯分别加入10 mL 粗酶液,根据溶液体积(mL)和硫酸铵饱和度常用表计算所需的固体硫酸铵的量,在冰盐浴条件下,边搅拌边向酶液中加入已研细的固体硫酸铵粉末,要少量多次以防止产生大量气泡,使得硫酸铵的饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%,加完后在4℃冰箱中静置2 h,在12 000 r/min 的离心条件下冷冻离心,留取沉淀,分别用pH8.0、0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液溶解。然后取1 mL 溶液并稀释20 倍,用邻苯三酚自氧化法分别测定其酶活性。
　　1.2.6 SOD 粗酶活性含量测定
　　1.2.6.1 邻苯三酚自氧化测定
　　取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl 代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm 比色皿中，在325nm 波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）[9]。
　　1.2.6.2 SOD 样液的活性测定
　　样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
　　2 实验结果与讨论
　　2.1 缓冲液冲液体积的优化
　　试验结果所示,随着pH 值的增加,酶活逐渐增大,当pH 值达到7.8 时酶活达到最大,pH 值再增加,酶活反而减小。
　　2.2 缓冲液冲液体积的优化
　　试验结果 所示,随着v/g 倍数的逐渐增加,酶活呈上升状态,当为1.5 倍时,提取得到的酶活力已接近最大值,再增加抽提倍数,酶活增加微小,并为以后的硫酸铵分级盐析和浓缩带来不便。
　　2.3 余甘子中SOD 酶的提取结果
　　余甘子中SOD 酶的提取采用3 因素3 水平进行正交试验结果。
　　结合单因素与正交实验得出：
　　各因素对提取率的影响程度分别为:B>A>C,最佳提取条件为:A3B1C3,即pH8.0、提取温度4℃、20ml 的磷酸缓冲液。此条件下提取的粗酶活性最大，为198.47 U/ml。
　　2.4 SOD 的纯化
　　试验结果所示饱和度达到100%时沉淀中SOD 酶活力最大。但饱和度达到90%时与其100%时酶活力相差不多,考虑到实际试验中100%饱和度很难达到,所以本实验选择饱和度为80%的(NH4)2SO4 进行分级盐析,实现了分级分离,将得到相对最大SOD 酶活。
　　3 讨论
　　本实验方法简便，所需实验仪器较少，可考察大规模生产的可能性。为余甘子的进一步研究提供一定的科学基础。由于余甘子不易贮藏，并且余甘子的产果期仅为一年中的八月末至九月末，这为实际研究带来很大的困难，经过综合考虑，本试验采用的是速冻方法保存余甘子，这样可以保留SOD 活性。
　　4 展望
　　第三代水果(刺梨、火棘、沙棘、余甘子等)大都被卫生部列入既是食品又是药品的材料名单[10]。近年来SOD 是开发添加剂、化妆品的热点，余甘子中SOD 活性较高，也成为提取SOD 的研究目标。余甘子中大量的天然VitC 也可作为回归自然的开发方向之一。总之，余甘子可以开发为药品、保健品、食品、添加剂、化妆品等，其开发前景广阔，资源市场配置好。

参考文献
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[2]杨顺楷,杨亚力,杨维力, 余甘子资源植物的研究与开发进展[J]. 应用与环境生物报，20O8，l4(6)：846-854.
[3]毛晓健,江菊,赵杰, 傣药麻夯板(余甘子)的研究概况[J]. 中国民族医药杂志, 2008,2(2):33-34.
[4]崔炳权，林元藻，余甘子的抗衰老作用研究[J].时珍国医国药，2007，18(9):2100-2101
[5]Liu FS (刘凤书)，Li SJ(李绍家)，Hou KW (侯开卫)，Hu TX(胡天喜)，Effects of emblic extracts and its derived
products on scavenging of free radicals。Chin J Trop Crops(热带作物学报)1998,19(3):48-52.
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[9]程伟贤,陈鸿雁,张义平等, 余甘子功能食品的开发及其类SOD 活力测定[J].食品与生物技术学
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[10]刘晓丽，赵谋明，余甘子的综合利用研究[J].食品与机械，2006,July,22(4):90-93.