探讨代谢组学技术及其在中医药现代化研究

　　1. 引言
　　
　　代谢组学（Metabonomics）是众多组学中的一种，是20 世纪90 年代中期发展起来的一门新兴学科，是一种研究生物体系中代谢物组的技术和方法[1]，是随着生命科学的发展而发展起来的，与其他组学不同的，代谢组学是通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或随时间的变化，来研究生物体系的一门新学科[2]。
　　随着“人类基因组计划”等重大科学项目的实施，中医药现代化的研究也进入了系统生物学的时代。代谢组学是系统生物学的关键技术和研究方法，主要是系统研究在新陈代谢的动态过程中代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质。它的出现为中医药复杂理论体系研究、中医药现代化提供了强有力的技术手段。代谢组学技术用于中医药现代化研究的最大优势，是能在继承和发扬中医药优势和特色的基础上，借鉴国际通行的医药标准规范，研究生命体的规律，认识疾病的本质，阐明中药的作用机理和药效物质基础，实现对中药的整体评价，增加中药的科技含量，确保中药能安全而有效地使用，从而有力地推动中医药的现代化、产业化、国际化进程。
　　
　　2. 代谢组学的技术和方法
　　
　　代谢组学研究的基本步骤包括:样品采集，样品预处理，数据采集、数据分析及解析。
　　首先要获得大量、稳定的生物样品(例如尿液，血清，血浆，组织、靶器官，细胞等)，样本进行一定的预处理后进行仪器分析，获得代谢组学数据，再对所获得的原始数据进行处理和解析。代谢组学研究力求分析生物体系中所有的代谢产物，所以整个过程中都强调尽可能的保留和反映总的代谢产物的信息。精确、灵敏、高通量的分析方法为代谢物分析提供检测手段，是代谢组学研究的基础，各种模式识别等计算技术从大量的分析信号中发现有用的特征模式，是代谢组学研究的重要工具。
　　
　　2.1 代谢组学的研究对象
　　代谢组学研究的对象是代谢组。所谓代谢组（Metabolome）是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体系新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000 的内源性小分子[3]。代谢组学测定的对象为生物标本，是生物体液(如血液、尿液、汗液等)、细胞提取物、细胞培养液和组织等。研究内容包括：
　　测定代谢物变化——研究系统生化谱和功能调节；应用代谢物组信息——进行生物信息、化学计量学、统计学分析[4]，了解生物体液中所包含的大量而复杂的内源性代谢物信息。
　　
　　2.2 代谢组学样品的采集与制备
　　样品的采集与制备是代谢组学研究的初始步骤也是重要的步骤之一，代谢组学研究要求严格的实验设计。首先需要采集足够数量的代表性样本，减少生物样本的个体差异对分析结果的影响。实验设计中对样本收集的时间、部位、种类等应给予充分的考虑。在研究人类样本时，还需要考虑饮食、性别、年龄、昼夜和地域等诸多因素的影响。此外，在分析过程中还要有严格的质量控制，需要考察如样本的重复性、分析精度、空白对照等。
　　根据研究对象、目的和采用的分析方法的不同，所需的样品提取和预处理方法也不同。
　　采用NMR 技术平台，只需对样品做较少的预处理即可进行分析。对体液的分析，大多数情况下，只要用缓冲液或水控制PH 和减少样品黏度即可；采用MS 进行“全”成分分析时，样品的处理方法相对简单，依据“相似相容原则”，脱蛋白后代谢产物通常用水或甲醇等有机溶剂提取，把非极性相和极性相分开，以便进行分析；采用GC 或GC-MS 时，常需对样品进行衍生化处理，以增加样品的挥发性。目前尚无一种能适合多种分析平台的代谢组学样品处理方法。应根据不同的分析仪器和研究目的采取相适的样品处理方法，并对处理方法进行优化。
　　
　　2.3 代谢组学的数据采集
　　完成样本的采集和预处理后，样品中的代谢产物需要通过合适的方法进行测定。由于代谢组学分析对象种类繁多，性质差异很大，浓度范围分布较广，在当前技术条件下仅凭借一种分析技术很难建立全局的无偏的代谢组学分析方法，最好采用联用技术和多个方法的综合分析。代谢组学中的监测技术主要有核磁共振（NMR）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、气质联用（GC-MS）、液质联用（LC-MS）等技术。
　　NMR 在代谢组学研究中最为常用[5-10]，特别是1H-NMR 以其对含氢代谢产物的普适性而成为最主要的分析工具，其优势在于能够实现对样品的无破坏性、无偏向性的检测，具有良好的客观性和重现性，样品处理简单，具有较高的通量和较低的单位样品检测成本。通过氢原子谱峰直观显示样品中组分含量，并且可与外界特定干预相结合，研究动态系统中机代谢产物的变化规律。NMR 虽然可以对复杂生物样品如尿液、血液等进行非破坏性分析，与质谱分析方法相比，它的缺点是灵敏度相对较低，动态范围有限，分辨率不高，有可能形成信号重叠，导致高丰度的分析物掩盖低丰度的分析物，很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。研究者通过发展超低温探针技术，提高了其分辨率和灵敏度，其检测灵敏度现已达纳克级水平[11-12]。
　　MS 相对于NMR 灵敏度低、检测动态范围窄、分辨率不高等缺点，MS 具有较高的灵敏度和专属性，可实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。随着质谱及其联用技术的发展，越来越多的研究者将色谱——质谱联用技术应用到代谢组学的研究[13-21]。
　　GC-MS 分析方法的优势包括能够提供较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考和比较的标准谱图库进行代谢产物的定性分析。但GC-MS 的样品前处理复杂，对于挥发性较低的代谢产物需要衍生化处理，预处理过程繁琐。而无法对难挥发性物质和热不稳定性物质进行分析，这些因素限制了其在生命科学领域的应用。GC-MS 常用于植物和微生物代谢指纹分析[22]。近年来采用新的衍生化方法对血清/血浆样品进行研究，拓展了GC 的应用范围，而成为代谢组学研究的常用工具之一。随着生物质谱的开发，采用气相色谱和飞行时间质谱(GC-TOF/MS)联用，应用封闭环运算法则来优化，提高了系统的稳定性，并且实现快速检测的目的[23]。
　　LC-MS 避免了GC-MS 中复杂的样品前处理，由于其较高的灵敏度和较宽的动态范围，已被越来越多地用于代谢组的研究[24-26]。非常适用于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定，其优点是进样前不需对样品进行衍生化处理，适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发的分子质量较大的化合物，灵敏度和选择性较好。其缺点是缺少现成的商业化数据库供比对，代谢产物的鉴定需要标准品进行验证。超高液相色谱技术（UPLC）对比传统的高效液相色谱（HPLC）有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度，提供更适合与质谱联用的借口，这无疑有助于更多代谢产物的检出，提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。UPLC 与MS 联用为代谢组学研究提供了更加高效、灵敏的方法平台，更适用于没有目标的代谢产物分析[27-29]。
　　
　　2.4 代谢组学的数据处理
　　代谢组学得到的是大量、多维的信息。为了充分挖掘所获得数据中的潜在信息，对数据的分析需要应用一系列的化学计量学方法。目前用于代谢组学数据分析处理的化学计量学方法很多[30、31]大多数是从检测到的代谢产物信息中进行两类（如药物干预前后的响应）或多类（不同药物干预代谢产物）的判别分类，以及生物标志物的发现。数据分析过程中应用的主要手段为模式识别技术，包括非监督（unsupervised）学习方法和有监督学习方法（supervised）。
　　非监督学习方法用于从原始谱图信息或预处理后的信息中对样本进行归类，并采用相应的可视化技术直观的表达出来，不需要有关样品分类的任何背景信息。该方法将得到的分类信息和这些样本的原始信息（如药物的作用方式或疾病的种类等）进行比较，建立代谢产物与这些原始信息的联系，筛选与原始信息相关的标志物，进而考察其中的代谢途径。用于这个目的的方法没有可供学习利用的训练样本，所以称为非监督（unsupervised）学习方法。
　　主要应用方法有主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）[32、33]、聚类分析（ClusterAnalysis，CA）、非线性映射等。
　　有监督学习方法用于建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。在这类方法中，由于建立模型时有可供学习利用的训练样本，所以称为有监督（supervised）学习方法。应用于该领域的主要方法有偏最小二乘法-判别分析（Partial Least Squares-Discrimination Analysis,PLS-DA）、辨别式功能分析(Discriminant Function Analysis，DFA)，非线性回归(nonlinear regression)，前馈神经网络(feedforward neural networks)等。
　　PCA 和PLS-DA 是代谢组学研究中最常用的模式识别方法。这两种方法通常以得分图（score plot）获得对样品分类的信息，载荷图（loading plot）获得对分类有贡献变量及其贡献大小，从而用于发现可作为生物标志物的变量。
　　在运用各种模式识别方法前，还需要对数据进行预处理，减少因各种因素引起的基线波动、峰位漂移、峰宽变化等对计算结果可能造成的干扰。将原始谱图数据转变为适合于多变量分析的数据形式，使相同的代谢产物在生成的数据矩阵中由同一变量表示，所有的样品具有相同的变量数。最后用于模式识别的数据为二维矩阵数据形式，行代表样品数目，列代表相应的单个测定指标(通常为代谢物的信号强度等)。Keun 等[34]采用VAST 法预处理数据，提高了PLS-DA 对代谢组数据的分类性能。Stoyanova 等[35]研究了一种对NMR 数据进行自动峰位矫正的算法，可有效用于大量的代谢组学数据预处理。
　　代谢组学数据解析离不开各种代谢途径和生物化学数据库（表1）。现在主要的数据库有人类代谢组数据库、KEGG、连接图数据库（Connection Map,DB）、METLIN、PathDB、EMP 项目、UMBBD、EcoCyc、Metacyc、LIGAND、生物化学途径（ExPASy）、互联网主要代谢途径（Main Metabolic Pathway on Internet, MMP）、Duke 博士植物化学和民族植物学数据库、Arizona 大学天然产物数据库等。
　　
　　3. 代谢组学与中医药现代化研究的关系
　　
　　代谢组学创始人、英国帝国理工大学的Jeremy Nicholson 教授认为，代谢组学与有着几千年历史的中医学在许多方面有相近的属性，它们的有机结合将有力的推动中医药的现代化进程。事实上，用代谢组学的方法来对比分析服用中药或采用中医疗法治疗前后人的体液所存在的不同，证实中国传统中医、中药的疗效，揭示其作用机制，已成为系统生物学研究中医、中药的重要手段，并有可能成为中国传统医学走向国际化的通用语言。
　　人体应该作为一个完整的系统来研究，应用代谢组学来理解疾病过程，与中医的整体观和辨证论治思维方式不谋而合。从系统生物学的角度看，生命体所产生的疾病是因其基因调节和蛋白质网络被“扰动”所致，这一被“扰动”可通过机体分泌的体液中内源性代谢物组的改变而反映出来。中药(尤其是复方)进入机体后，起效的是中药中的原形成分或代谢产物或与机体作用形成的新成分，三者构成体内中药成分的代谢物组。而中药代谢物组通过多器官、多系统、多靶点，协调干预人体内源性代谢物组来治疗疾病。中药代谢物组的作用都会反映到各种生物化学途径上，使内源性代谢物组中某种或多种物质的浓度和比例发生变化。
　　而内源性代谢物组变化特征模式，提供了药物作用机理和作用靶点的信息。一方面，通过辨识和解析内源性代谢物组的变化，可以了解与生命体生理或病理状态相关的一系列生物学事件，甚至揭示生物标志物，从而促进中医“证”本质的研究、中医辨证的科学化和定量化，深层次理解中医脏象理论，预测疾病的发生。另一方面，通过追踪中药影响体内内源性代谢物组的组成和变化，可以整体性评价中药的疗效和安全性，阐明中药作用的机理，并解决中药现代化的瓶颈——中药药效物质基础的阐明。
　　由此可见，机体——疾病——中药作用，环环相扣，是一个动态的、紧密联系的整体过程，代谢组学则是连接的枢纽和中心。中医学“整体观、辨证论治、形神统一”的理论和诊疗体系不同于西医因果对应的线性思维方式，中药现代化研究应当坚持以中医理论为指导，对中药进行全方位的研究，采用的方法应有别于西药研究的方式，代谢组学全景式、整体互动性的特点与中医药的整体观念、证候的复杂体系及动态连贯性、中药作用的多靶点和突出整体效应不谋而合，是中医药现代化的最佳切人点。
　　
　　4. 代谢组学在中医药现代化研究中的应用
　　
　　4.1 代谢组学用于中医症候的研究
　　中医的“证”是论治的起点和核心。“证”是指在疾病的发生、发展过程中，一组具有内在联系的、能够反映疾病过程在某一阶段的病理病机，是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态，其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群。辨证论治是中医药理论的核心。其实质是根据个体心身特点及其当时的疾病反应状态而有针对性地进行个体化的治疗和预防，从而达到最佳治疗效果。辨证施治既不同于对症治疗，也不同于西医的辨病治疗。由于每一个证候都有其外象(外候)与内涵，外候是望、闻、问、切四诊所获得的信息整理而得，很难量化，由于辨证是由外揣内，在具体运用上受到医患双方主观因素的影响，难以客观化和量化，所以必须通过“证”的内涵研究。采用代谢组学技术，通过对某一病证相关特定组分的共性加以分析、判断，能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况；同时，代谢组学还有助于疾病的生物标记物的发现而达到辅助临床诊断的目的。它能够通过检测不同时间患者的尿液、血液、唾液等生物样本，对这些由疾病引起的代谢产物的响应进行分析（即代谢物组的分析），可以提高诊治的科学化、定量化，避免了人为因素的误诊。
　　本课题组应用肾上腺素结合冰水制造大鼠急性血瘀证模型[36]，基于UPLC-Q TOF/MS技术和PCA、PLS-DA 等化学计量学方法对大鼠尿液进行分析，结果显示模型对照组和空白对照组的代谢谱型能被区分，说明“应用肾上腺素结合冰水制造大鼠急性血瘀证模型”导致了机体代谢谱型的改变，主要引起如下潜在生物标志物的改变，即琥珀酰鸟氨酸、犬尿喹啉酸、鹅去氧胆酸和胆酸，为传统医学的“证”本质研究提供了客观依据。
　　本课题组应用线栓法阻塞大脑中动脉制造大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型[36]，基于UPLC-Q TOF/MS 技术和PCA、PLS-DA 等化学计量学方法对大鼠尿液进行分析，结果显示模型对照组和假手术组的代谢谱型能被很好地区分，说明“线栓法阻塞大脑中动脉制造大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤”导致了机体代谢谱型的变化，主要引起如下潜在生物标志物的改变，即苯丙氨酸、硫辛酰胺、犬尿喹啉酸和琥珀酰鸟氨酸，为中医脑中风的机制研究提供了借鉴。
　　陈家旭等[37]以慢性束缚方法制作应激大鼠模型，运用动物行为学评定和以方测证等方法确定该模型为肝郁脾虚证候模型。经NMR 数据采集与分析证实：正常组与以慢性束缚方法制作应激大鼠肝郁脾虚证模型组之间有着代谢产物的不同，模型组随着造模时间长短的不同，其代谢产物有所变化。中医证候之间可能存在着非常明显的代谢产物的不同，这种不同是基于不同证候存在着不同物质代谢或其代谢网路的改变。
　　杜惠兰等[38]采用1HNMR 方法，通对中医虚寒证、虚热证患者血清中内源性代谢物变化的分析，确定了中医虚寒证和虚热证的相关生物标志物，从而明确不同类型寒热证产生的原因，对临床诊断具有指导意义。
　　高月、颜贤忠等[39]建立了三种不同的血虚证动物模型及其代谢谱，并通过与正常动物代谢谱的比对，确定了与各型血虚证相关的生物标志物，从而明确了不同血虚证产生的原因，并从代谢组学的角度揭示了其发病机制。
　　黄穗平等[40]以中医理论“脾在液为涎”为突破口，以脾气虚证作为切入点，从唾液代谢组学角度探讨“脾气虚证”的科学内涵，提示脾气虚证、湿热蕴脾、正常人等三组之间唾液中的代谢网络存在明显的差异。并确证了相关的生物标志物。
　　中医证候的生物学基础也可能从代谢组学研究中找出特异的标志性代谢产物，用生物信息学方法分析生物标志物的功能，来确定“证相关代谢谱群”。“证”的研究可以和处于科学前沿、综合程度很强的系统生物学方法相结合，同时也是生命科学和临床医学相结合。这将把“证”的研究再次推向科学发展的前沿,成为中医现代化最重要的研究方向之一。
　　
　　4.2 代谢组学用于中药作用机制的研究
　　中药是多成分的复杂体系，人体是更复杂的生命系统，这就决定了中药的药效和作用机制具有复杂的非线性特征，表现出多成分、多层次、多靶点、多代谢途径的特点。因此，采用经典的药理学方法去研究中药的作用机制，存在着一定的理论差距和现实的技术瓶颈，即使得出结论，其可信性也值得商榷[41]。这是制约中医药现代化的主要问题之一。中药作用机制的研究是阐明中医辨证论治原理和推进中医药现代化的重要部分，方剂配伍原理的揭示不仅为中医临床合理使用方药提供理论支撑，而且为新药研发提供科学依据[42]。反应机体状况的内源性分子集合与机体功能状态之间有着密切的关系，机体的病理生理变化和中药作用最终通过代谢物组的变化表达出来。中药成功的治疗疾病必须使代谢网络中的缺陷部分正常化，同时不得干扰其他维持健康所必须的代谢途径的调控。代谢组图谱能同时反映代谢网络中多个生物化学途径的成百上千个化合物。代谢组学研究“代谢指纹图谱”，不仅研究药物本身的代谢变化，而主要是研究药物引起的内源性代代谢物的变化，更直接反映体内生物化学过程和状态的变化。通过认识“代谢指纹图谱”变化的原因，阐明药物作用靶点或受体。
　　本课题组研究发现[43]：沙棘提取物能使“应用肾上腺素结合冰水制造大鼠急性血瘀证模型”的代谢谱型向正常动物回归，其作用机制可能与苯丙氨酸、色氨酸、琥珀酰鸟氨酸、犬尿喹啉酸、鹅去氧胆酸和胆酸等潜在生物标志物有关。
　　本课题组研究发现[36]：灯盏细辛注射液减弱或取消了外界刺激因素“线栓法阻塞大脑中动脉”对机体的作用，使“线栓法阻塞大脑中动脉制造大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型”
　　的代谢谱型向正常动物回归，其作用机制可能与犬尿喹啉酸、琥珀酰鸟氨酸和亮氨酰脯氨酸等潜在生物标志物有关，可能涉及“色氨酸-犬尿喹啉酸”和“琥珀酰鸟氨酸-尿素循环-NO”
　　等代谢途径。
　　卜平等[44]应用基于核磁共振（NMR）的代谢组学方法研究荷叶生物碱干预非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠的血浆、尿液代谢表型改变及其与常规检查的相关性，探讨NAFLD的代谢机制及荷叶生物碱干预NAFLD 的相关作用机理及靶点。通过研究发现荷叶生物碱主要通过调节机体脂质代谢、能量代谢紊乱，缓解氧化应激、脂质过氧化损伤等作用，抑制大鼠肝脏脂肪性病变、炎症反应以及肝脏胶原沉积，对大鼠非酒精性脂肪肝病具有一定治疗作用。
　　梁逸曾等应用代谢组学的方法，用HPLC-DAD-MS 进行样品分析，对中药尖萼耧斗菜、中药组分黄连素等对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制的确定进行了探索性研究。通过与已知作用机制的9 种常用抗菌素处理后的金黄色葡萄球菌培养基中获得的培养液的代谢物谱进行比对，并对代谢谱进行了主成分分析。结果显示，尖萼耧斗菜的投影点与氯霉素、琥乙红霉素、林可霉素、链霉素和四环素的投影点聚集在一起，表明尖萼耧斗菜的作用模式与这些抗菌素的作用机制相似，都是作用在蛋白质的合成方面。另一些中药的活性组分，如小檗碱、芫花素和芹菜素的投影点与利福平和氟哌酸聚集在一起，提示它们是对金黄色葡萄球菌核酸起作用[45-46]。这一结果表明，在已知9 种作用机制的抗生素的基础上，用代谢谱结合主成分分析探究中药可能的作用机制和寻找其主要的生物标志物，是一种初步探寻中药的抗菌作用机制和寻找主要的生物标志物的可行的方法。这种方法为寻找中药的确切分子靶标指出了大概的方向，为快速找到中药的分子靶标提供了可能。
　　蒋宁等应用代谢组学方法比较六味地黄汤及八味地黄汤的作用机制，以12 月龄雌性和雄性快速老化模型小鼠(senescence accelerated mice,SAM) 的快速老化亚系SAM-prone/8(SAMP8)及抗快速老化亚系SAM-resistance/1(SAMR1) 为动物模型，灌胃给予六味地黄汤和八味地黄汤1 个月后，采集血清，应用代谢组学的主要研究技术NMR 方法检测血清中的代谢产物，结果表明，六味地黄汤和八味地黄汤均能够对SAMP8 血清代谢物产生影响，可能主要通过对葡萄糖、胆碱和脂类的含量的调节改善SAMP8 能量代谢障碍和学习记忆能力的下降[47]。
　　黄玉荣等[48]用代谢组学方法研究钩藤多动合剂的药效作用及生化机制，采用HPLC 测定给药动物血清中多种内源性神经递质的动态变化，从代谢物组成和含量的经时变化发现具有疗效的生物标志物，表明该中药能调整单胺类神经递质的失衡而发挥治疗作用。亦有研究通过比较中药淫羊霍的化学成分谱与进入血清及尿中排泄的化学成分及代谢物谱考察淫羊霍补肾作用的物质基础[49]。
　　
　　4.3 代谢组学用于中药的安全性评价研究
　　新药安全性评价的目的是提供新药对机体危害程度的科学依据，预测上市新药对人类的危害程度。传统的新药安全性评价是通过给一定数量的实验动物使用大剂量待评价药物，观察其毒性特征，然后将实验结果外推到人群。然而这种方法存在着一定的缺点，如种属差异、实验周期长、实验成本高等。中药具有效毒二重性，长期对中药毒效关系的认识主要以经验为依据。近年来，随着中药及其制剂在世界范围内的广泛应用，有关中药的安全性问题的报道日益增多，尤其是关木通和含有关木通的中成药如龙胆泻肝丸等，引起的肾毒性更为人们普遍重视[50-63]。并致使美国、加拿大、英国、日本等不少国家先后限制了含有马兜铃酸的中药的进口，对中药的安全性评价、中药市场、中医的世界信誉和中药现代化产生了负面影响。
　　中药成分复杂，具有多靶点交叉作用的特点，在毒性的发生上有时难以用单一器官或组织的毒性反应来评价。应用代谢组学的方法研究不同时间点生物体液，在毒性的“终点”位置分析代谢谱的改变，可动态无伤害地检测机体生物体液的代谢图谱的变化，动态评价药物毒性效应，该分析技术简便快捷。目前，代谢组学已经作为一种独立的技术被广泛地应用于候选药物的毒性评价。2002 年美国毒理学学术年会对此进行了广泛的专题讨论，美国食品与药品管理局(FDA)已经接受代谢组学研究的结果作为新药申报和注册的重要参考指标。代谢组学可以早期诊断或预测毒性的出现，监测尚未引起组织病理学变化的毒性,减少药物不良反应的发生率，具有临床应用潜力。代谢组学还被国外六大医药公司（Pfizer, Bristol-MeyersSquibb,Eli lilly,Hoffmann-La Roche,Novo Nordisk,Pfizer,Pharmacia）纳入其药物研发方案中，利用1H-NMR 技术、模式识别和专家系统，根据已知毒性物质的病理效应对被检测的生物组织进行分类，寻找各类生物标志物，建立毒性预测的专家系统，以缩短药物研发时间，减少损失。
　　以马兜铃酸引起的肾毒性为例，从病理研究结果来看，可能是马兜铃酸引起肾间质炎性细胞浸润和成纤维细胞聚集，并分泌大量细胞基质所致，但这未能阐明马兜铃酸毒性的物质基础，也就无法确定并去除其毒性组分。而代谢组学能从整体水平阐明中药对机体内源性代谢物组的影响。对关木通等中药中的主要毒性成分马兜铃酸毒性作用的代谢组学研究表明，马兜铃酸能够引起肾近曲小管和肾乳头的损伤以及轻微的肝脏损伤[64-65]。
　　樊夏雷等[66]开展了基于GC-TOF-MS 的关木通肾毒性代谢组学研究，关木通给药后，利用GC-TOF-MS 及模式识别技术为核心的代谢组学方法对尿样及血浆样品进行研究。结果表明，给药后2d、4d 大鼠尿液及血浆中代谢组水平与给药前产生明显变化，内源性代谢产物谱随时间动态变化明显，能够区分出各自的变化趋势，表现出毒性发生、发展的动态过程。
　　李建新等[67]以生物核磁共振结合模式识别技术和主成分分析法探讨雷公藤甲素口服给药对大鼠尿液内源性代谢产物的影响，结果发现大鼠尿液的代谢物谱与雷公藤甲素对肾脏造成损害作用密切相关。
　　Garrod 等[68]用HR-MAS-HNMR 原位检测到其引起肾皮质、肾乳头和肝脏一过性的戊二酸(肾脏受到损伤时，尿液中的一种代谢标志物)升高。
　　综上所述，应用反应整体思想的代谢组学评价中药的毒性，对中药毒性进行科学的、系统的、综合的评价研究，对于确保中药的合理、安全、有效用药，建立现代中药毒理评价体系，指导临床拟订合理的临床用药方案、剂量和给药间隔均有指导意义。
　　
　　4.4 代谢组学与中药的质量控制
　　我国中药质量标准从无到有，从宏观至微观，发展较快。目前对于中药的质量控制一般基于化学成分和活性研究，建立中药中的某一或几个有效成分(主成分) 的定性、定量分析方法，这种方法未能切实全面地反映中医药方剂特征。将代谢组学运用在中药质量控制方面，可以归属为中药指纹图谱技术。一方面，针对中药及其制剂产品进行大量的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，表征中药的特性，表达成品的质量，以达到对原药材和工艺操作的的质量控制，达到指纹图谱的可操作性、稳定、量化的目的，提高中药质量控制的水平。另一方面，将传统的化学成分分离、纯化技术与现代的液相色谱——质谱联用技术对指纹图谱中的指纹峰进行系统的指认和定量研究，寻找指纹特征和药效的相关性，即“谱效关系”研究，探讨指纹图谱的生物等效性研究等，使指纹图谱技术更加合理可靠的控制中药质量。
　　近年来研究者通过对贝母、冬虫夏草、四季青、金银花等中药及其相关复方的化学成分深入研究，阐明了其有效部位和化学成分，建立了这些药材和复方的有效成分群化学特征图谱和多个指标成分同时定量相结合的质量控制方法。
　　Chen 等[69]用UPLC-TOF/MS 研究了三七炮制过程中化学成分的变化。在三七制剂的质量研究中，主要采用指纹图谱，依托质谱的联用技术，从三七的栽培、采集、加工，优良种植规范(GAP)基地的建立，总皂苷的提取，制剂工艺，对照(标准)提取物的制备等，进行全程质量控制，保证了药材、提取物及成品的质量稳定。
　　在银杏叶的质量研究中[70]，在LC-UV-MS 指纹图谱中发现了一些微量成分并鉴定了3个新的内酯类化合物，其中银杏内酯K 的生物活性较银杏内酯B 还高，从而对原有质量标准进行修订。
　　Wang 等[71]在研究银杏制剂时，发现在日出和日落时采集的银杏叶中，银杏内酯、白果内酯和黄酮类化合物的成分和含量均有变化，其中日落时含量较高。此外，用NMR 分析市售的银杏制剂时，6 个样品中只有1 个样品含银杏内酯。他们认为用检验过的不同的制剂给予动物或病人服用，所得的代谢组数据用多变量数据分析(MVDA)，有可能得出最佳的制剂组成。
　　基于这种代谢组学思想的化学分析平台得出的中药组分特征图谱将进一步解决如何体现中药和制剂的整体性和复杂性的难题，是中药现代化研究的一个基本突破口。另一方面，中药质量控制应重点着眼于其体内疗效的变化，即以体内来评价体外，只有经体内评价真正发挥作用的效应物质才能成为中药质量控制的标准。任何药物都是通过与人体的相互作用来发挥疗效的，中药所含成分极其复杂，要想将其成分逐一地阐述清楚，再进行药效、药理学研究，可能性小，且成分分离后，彼此之间的相互作用消失。为此要改变传统的中药研究模式——注重药物对人体的作用，转向重视人体对药物的作用，建立符合中药多成分、多靶点协同作用特点、与体内疗效直接相关的中药质量控制新体系。
　　
　　4.5 中药的体内代谢组学研究
　　随 着 代谢组学的发展， Clayton 等[72] 于2006 年提出了“ 药物代谢组学”(Pharmaco-metabonomics)的概念：以代谢组学为平台，通过给药前生物样本的代谢轮廓分析预测给药后的药物反应表型，即以动物给药前尿液代谢物所包含的信息，预测个体对药物的代谢和毒性反应的差异。药物代谢组学是代谢组学的进一步发展，是代谢组学技术与医药学研究有机结合的产物[73-76]。药物代谢组学是在系统生物学的背景下，以代谢组学技术，特别是样品分析和多维数据处理技术为平台，对个体的药物反应表型进行预测以实现未来个性化治疗为目标的新的组学思想。药物代谢组学通过给药前生物样本的代谢轮廓分析，预测可以采用的药物治疗方案以及药物反应，在治疗过程中随疾病的不同表型进行针对性的药物治疗，并按疾病不同进程调整药物剂量、甚至药物的种类。
　　中药的体内代谢组学研究是以中医的整体观念和辨证论治思想为指导，结合整体性思路的代谢组学方法，把中药作为一个有机的整体，对中药成分在体内的作用影响代谢物组变化情况进行动态跟踪检测、定量和分类，明确中药进入人体后如何发挥作用，影响机体代谢。
　　揭示中药成分结构——代谢——活性的相关性。中药体内的代谢组学研究，对于证实传统中医中药的疗效，阐明中药药效作用机理和效应物质基础，建立科学的中药质量控制体系，确保临床中药的安全和有效，具有重要的促进作用。
　　在药物代谢物组学研究中，Plumb 等人[77-78]利用LC-MS 做出了出色的工作，他们采用LC-MS 对鼠尿中三种候选药物的代谢情况进行了检测，通过将空白尿液与给药尿液LC-MS谱图的比较分析，成功的将三种药物的代谢差别在质谱中区分出来。此外，他们还利用液相色谱和飞行时间质谱(LC-TOF/MS)联用技术在事先不清楚受试药物结构的情况下对体液中的药物代谢产物进行了检测,结合化学计量学的方法对谱图进行分析，在复杂谱峰中分析出了代谢产物的质谱峰,避开了大量内源性物质峰的干扰。
　　
　　5. 展望
　　
　　代谢物组学同基因组学、蛋白质组学、生物信息学一样，是系统生物学的重要组成部分。代谢物组学处于初步发展阶段，大量基础工作仍将有待完善。随着研究的深入，代谢组学研究必将在揭示基因功能的功能基因组学研究中发挥更大的作用：它能帮助人们更好更深地了解生物体中各种复杂的相互作用、生物系统对环境和基因变化的响应，为人们提供一个了解基因表型的独特途径。临床诊断、新药开发和营养科学也将从代谢指纹图谱研究中受益。此外，代谢组学技术还可用于微生物和植物表型的快速鉴定，并可指导开发具有重要应用价值的新型代谢产物。
　　中医药现代化，一个亟待解决的问题是建立能体现中医药自身特点和优势，同时又能被国际医学界接受的疗效评价和机制研究方法。近年来系统生物学及相关技术的快速发展，为从多学科、多视角认识中医药疗效机制提供了重要的方法学基础和技术条件，如果能将整体性思路的代谢组学技术与中医的整体观念、辨证论治、治未病和藏象理论等方面相近属性进行有效组合，必将进一步加快中医药研究的现代化进程，推动我国的中药研究与开发与国际双向接轨。中医药与以代谢组学为核心的系统生物学的结合，将是一个极富创造性、并可能是引领中医药现代化的重要之举。

　　
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