一种简便的用于中药质量评价的代谢组学方法

　　0 引言
　　
　　中药质量标准通常选择指标成分或大类成分进行控制。然而，由于缺乏符合中医药特色的药理学与药代动力学研究方法与结果的支持，难以明确中药成分与临床疗效与毒性的相关性。因此，中药多成分综合控制方法仍然是目前中药质量评价的最佳策略。指纹图谱即是这类方法的代表，已被很多国家广泛采用，即将颁布的中国药典2010 版也已纳入指纹图谱分析。但是指纹图谱技术一般评价相似度，而对质量差异及其原因的分析能力不足。代谢组学(metabolomics)是本世纪新兴的一门学科，是全局系统生物学的重要组成部分[1]。代谢组学的核心是一种分析复杂系统的技术，即无偏差地对样品中的全部小分子物质进行定性与定量分析，据此通过强大的多变量数据分析方法研究各种因素对样品中物质的整体影响。因此，与其说代谢组学是一门学科，不如说它是一种新型的技术方法，而该技术已经衍生到了各个基础学科的研究中。在中医药领域，代谢组学技术的系统性与整体性特点与中医药传统基础理论不谋而合，已用于中医病证模式研究[2]、中药作用机制研究[3]、安全性评价[4]与质量评价等。
　　与指纹图谱技术相比，代谢组学技术用于中药的质量评价与控制，不仅能分析中药质量的相似度，更能敏感直观地表征各种成分的微小变化所导致的总体差异，并自动无偏差地解析出对质量差异贡献较大的成分。例如，基于NMR 的该技术可快速分辨不同产地人参的质量差异[5]；基于UPLC-TOF 的该技术可快速分析五种人参属药材的质量差异[6]，三七不同药用部位的质量差异[7]，生三七与蒸三七的质量差异[8]，并阐明炮制工艺对蒸三七质量的影响[9]。该技术符合中药系统性和整体性的特色与需求，在中药质量评价中具有非常大的应用前景。但是，目前该技术通常使用昂贵的设备（如NMR、UPLC-MS、LC-MS 与GC-MS），需要高度专业的技术操作，难以推广应用。若能使用普通HPLC-UV 设备进行研究，将大大提高该技术应用与推广的可行性。为此，本研究选择醋柳黄酮为研究对象，探索使用普通HPLC-UV 设备进行基于代谢组学技术的中药质量评价的可行性与有效性。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 药品、试剂、标准品甲
　　醇购于 Burdick&Jackson (SK Chemical, Ulsan, Korea)。甲酸(纯度≥96%)和乙酸铵(纯度≥97%)购于TEDIA (Fairfield, OH, USA)。槲皮素(97.3%)由中国药品生物制品检定所提供，异鼠李素(99%)与山奈酚(99%)购自上海同田生物技术有限公司。
　　
　　1.2 样品制备
　　六批醋柳黄酮 (total flavones of sea buck- thorn , TFS, 批A-F)由川大华西药业股份有限公司赠送，其总黄酮含量分别为11.38%，10.34%，13.68%，10.58%，11.50%，12.49%。精密称取各批样品20±0.5 mg，用10 mL 甲醇溶解，50 °C 超声处理20 min，放冷至室温后，以等体积水稀释，过滤，收集续滤液作为样品Ⅰ，用于分析样品中的黄酮类化合物。超声提取的母液，不经稀释，直接过滤，收集续滤液作为样品Ⅱ，用于分析样品中的三萜/甾醇类化合物。取六个批次的样品Ⅰ和样品Ⅱ各100 μL，分别合并，作为样品QCⅠ和QCⅡ[10-13]。各样品进样20 μL 分析。
　　
　　1.3 色谱分析　　
　　高效液相色谱仪为安捷伦1200 HPLC- UV系统，色谱柱为Eclipse XDB C18 (4.6×150 mm,5 μm)，柱温35℃。样品Ⅰ采用梯度洗脱方法，流动相为5 mM 乙酸铵/0.2%甲酸水溶液 (A)-甲醇 (B)；梯度条件为35-45 % B (0-10 min)，45-50 % B (10-30 min)，35 % B (30-50 min)；流速为1 mL/min；检测波长为254 nm。样品Ⅱ采用等度洗脱方法，流动相为89 % B；流速为1 mL/min；检测波长210 nm。样品Ⅰ与样品Ⅱ的分析批中，开始时均以QC 样品连续进样三次以平衡色谱系统；每1-3 个测试样品穿插1 个QC 样品，以此监控色谱系统可能的漂移。槲皮素、山奈酚与异鼠李素的保留时间以相应的对照品确认。
　　
　　1.4 数据处理
　　以安捷伦ChemoStation 色谱工作站软件进行第一步数据处理。选择峰10（未知）和峰27（异鼠李素）为参照对齐样品Ⅰ中各色谱峰的保留时间。选择峰32（未知）和峰40（未知）为参照对齐样品Ⅱ中各色谱峰的保留时间。样品Ⅰ和样品Ⅱ的积分保留时间范围分别为3-30 min 和2-15 min，斜率灵敏度均为1，峰宽分别为0.01 min 和0.1 min，最小积分峰面积分别为5 和100，最小积分峰高分别为0.3 和10。经过保留时间对齐与积分处理，样品Ⅰ和样品Ⅱ中分别检测到28 与12 个物质，分别纳入数据集Ⅰ和数据集Ⅱ中。分析批的有效性（即色谱系统的漂移情况）经QC 样品的分析确认后，数据集Ⅰ和数据集Ⅱ可顺序合并为数据集Ⅲ。各数据集合包括了样品编号、色谱峰编号、保留时间与峰面积。各数据集导入SIMPCA-P+12.0 软件 (Umetrics, Ume?, Sweden)，参照一个最近的文献报道方法进行多变量数据分析[14]。
　　在进行多变量分析之前，可采用尺度化 (scaling)、居中 (centering)、转换 (transformation)对数据集进行预处理。居中使所有变量的均值归零，因此强调了数据之间的差异而不是相似度[15]。Pareto 尺度化用标准偏差的平方根作为尺度因子，经此处理后主成分分析法(principal component analysis, PCA)能够扩大低浓度变量的影响并保证噪音对结果无较大影响[14,15]。数据集Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均采用居中和Pareto 尺度化预处理，未进行特定的数据转换。PCA分析可以初步观察数据集中各样品的聚集与溢出情况，随后以偏最小二乘法-判别分析(partial least square-discriminant ana- lysis, PLS-DA)对各样品进行分类，并结合PLS-DA 权重矩阵的等级聚类分析 (hierarchi- cal cluster analysis, HCA)，识别对此分类有显著贡献的变量。
　　
　　2 结果和讨论
　　
　　2.1 HPLC 方法的建立
　　黄酮类化合物在254nm 和350-370nm 处显示出强的吸收[16]，而三萜类和植物甾醇类只在200-210nm 间显示较弱的吸收[17]。单个HPLC-UV 方法难以实现TFS 中“全部”物质的分离与分析。因此，本研究采用梯度洗脱方法在254nm 处分离TFS 中的黄酮类化合物，用等度洗脱方法在210nm 处分离三萜/甾醇类化合物。两个方法互相补充，二者的色谱图可以合并，实现了TFS 中“全部”物质的分离与分析清晰地显示了两个色谱方法的系统漂移程度的差异，等度洗脱方法的稳定性显著优于梯度洗脱方法，表明分析批的有效性必须采用QC 样品数据的多变量分析进行确认。
　　
　　2.2 分析方法的验证
　　分析方法的稳定性是代谢组学研究的关键。如果分析方法没有得到很好的验证，多变量分析方法的结果显示的仅仅是分析方法的系统漂移，而非样品的真实差异[10,18]。为数据集Ⅰ与数据集Ⅱ的PCA 分析的打分图，清晰地显示出了六个批次TFS 的质量差别。但是，很明显可以发现数据集Ⅰ中的QC09、QC10、QC11 样品相对于前面聚集的QC 样品逐渐向左上方偏移；而数据集Ⅱ中的所有QC 样品均聚集良好。此分析结果表明，分析批中处于QC01-QC09 之间的测试样品才能纳入数据合并，进入数据集Ⅲ。
　　
　　2.3 TFS 的质量评价
　　数据集Ⅲ PCA 分析的打分图见，可以清晰地看出六个批次TFS 的质量差异。进一步的PLS-DA 分析表明，六个批次的TFS 按其总体质量差异可以分为四类，PLS-DA 打分图，相应的PLS-DA 权重图见。PLS- DA 分析的权重矩阵，经HCA 分析，可自动地根据各变量对PLS-DA 分类的贡献大小进行等级聚类处理。HCA 分析的结果见，在权重为0.2 的水平上各变量可聚集为五类，该聚类模式同时可见于PLS-DA 权重图，并表现为同一种颜色。显然，槲皮素、山奈酚、异鼠李素与另五种未知成分（以色谱峰编号表示）对于六批TFS 的分类有着显著贡献。
　　有趣的是，如果比较各批样品的总黄酮含量与PLS-DA 的分类结果，可以发现PLS-DA 分类与总黄酮的含量呈现良好的相关性。这一推论可采用PLS 回归模型进行验证。以数据集中各色谱峰面积为自变量，总黄酮含量为因变量建立PLS 回归模型，该模型的R2X、R2Y 和Q2 分别为0.823、0.991 与0.974。以PLS-DA 模型预测的总黄酮含量数据 (YPred)与实际数据 (YVar)之间的比较见。以上分析结果表明，本研究所采用的方法能够很好的预测TFS 中总黄酮的含量；从另一方面而言，本研究结果也提示总黄酮的含量测定是对TFS 进行初步质量控制的一种有效方法。
　　
　　3 结论
　　
　　本研究提供了一种中药质量控制中的代谢组学方法。尽管这种基于HPLC-UV 的代谢组学技术尚存在一定的缺陷，例如使用的紫外检测器为非通用型检测器，缺乏较高的灵敏度，且分析结果不能提供测定组分的化学结构信息等，但是，本研究的结果表明，作为一种较为初步的、相对经济的方式，这种方法具有操作简便、仪器设备需求低与数据处理自动化等明显性优点。本方法可以快速地区分中药的综合质量差异，并自动地筛选出对此综合差异贡献较大的中药成分，可广泛用于一些具有良好研究基础的确有疗效的中药的质量再评价，具有相当广阔的应用前景。

　　
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