关于焦山楂稳定性及保质期的研究

　　0 引言
　　
　　山楂为传统常用中药，为蔷薇科植物山里红 Crataegus pinnatifida Bge.var.major.N.E.Br.或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实[1]。味酸、甘，微温，归脾、胃、肝经。临床用于消食化滞、活血散瘀等[2]。我国传统中医理论认为：山楂炒焦后能增强其消食导滞作用增强。用于肉食积滞，泻痢不爽[3]。
　　《中华人民共和国药典2005 版》规定焦山楂的炮制标准为：取净山楂，照清炒法（附录Ⅱ D）炒至表面焦褐色，内部黄褐色[4]。
　　目前，对山楂及其炮制品成分及药理作用研究比较多[5~8]，但是对其储存条件及稳定性研究比较少，因此我们试图以焦山楂药材在常温留样及加速实验条件下不同成分含量的变化来探索焦山楂稳定性及保质期。
　　
　　1 仪器、试剂、试药及药材
　　
　　1.1 仪器
　　岛津 LC-10ATvp 液相色谱仪，SPD-M10Avp 检测器，岛津Class-VP 色谱工作站；SartoriusBP211D 电子天平（德国赛多利斯股份有限公司，感量0.1mg）；autoscienceAS5150A超声波清洗器；电热恒温水浴锅；50ml 碱式滴定管（分度值0.1ml）；TGL-16G 高速离心机；万用电炉；水浴锅；烘箱等。
　　
　　1.2 试剂及试药
　　甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸等为分析纯。
　　
　　1.3 药材
　　山楂饮片购自成都荷花池中药材专业市场，经成都中医药大学中药鉴定实验室鉴定为蔷薇科植物山里红 Crataegus pinnatifida Bge.var.major.N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实。
　　
　　2 实验方法及结果
　　
　　根据《中华人民共和国药典2005 版》一部规定的饮片稳定性考察项目和要求，根据本品饮片质量标准（草案）[9]及《中华人民共和国药典2005 版》一部附录Ⅱ B 药材检定通则项下的有关规定，参照《中华人民共和国药典2005 版》山楂项下检测项及本实验室前期实验研究对焦山楂进行稳定性考察。
　　取焦山楂三批，批号为071001、071002、071003，均为2007 年10 月生产。 按市售包装，采用常温留样试验考察，时间从2007 年10 月至2009 年10 月，除生产当月（0 月）取样考察一次外，以后分别在放置1 月、2 月、3 月、6 月、12 月、18 月各取样考察一次。加速试验考察，时间从2007 年10 月至2008 年1 月，除生产当月（0 月）取样考察一次外，以后每月取样考察一次，1 月、2 月、3 月共考察3 个月。
　　常温留样考察条件：温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％；加速试验考察条件：40℃±2℃、相对湿度RH75%±5%。
　　
　　2.1 样品制备
　　取净山楂，投入锅温适当的滚筒炒药机中，以老药工的传统炮制经验为标准，炒至表面焦褐色，内部黄褐色。取样适量做常温留样试验考察和加速试验考察，分别在规定时间取样考察。
　　
　　2.2 样品考察
　　2.2.1 外观性状
　　取上述供试品，观察其外观性状：本品形如山楂；为圆形片，皱缩不平；外皮焦褐色，具皱纹，小斑点仍可见；果肉黄褐色；气焦香；味酸、微涩。三批样品外观一致，在常温留样试验考察第3、6、12、18 个月及加速试验考察第1、2、3 个月外观基本无变化。
　　2.2.2 鉴别
　　显微鉴别：粉末深褐色；石细胞较多，成群或单个散在；层纹明显，孔沟较粗；较小的石细胞有时排列成行，并与纤维相连；草酸钙方晶散在，草酸钙簇晶单个散在，棱角较钝；纤维成束或散在，多为淡黄色，纤维较长，壁极厚，孔沟细密；淀粉粒散在，部分淀粉粒糊化。在常温留样试验考察第3、6、12、18 个月及加速试验考察第1、2、3 个月显微鉴别基本无变化。
　　薄层鉴别：参照《中华人民共和国药典2005 版》山楂鉴别项下方法对三批供试品进行鉴别。取本品粉末1g，加乙酸乙酯4ml，超声处理15 分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1ml 含1mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典2005 版》一部 附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20:4:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液(3→10)，在80℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；置紫外光灯(365nm)下检视，显相同的橙黄色荧光斑点。结果见在常温留样试验考察第3、6、12、18 个月及加速试验考察第1、2、3 个月均可检出与对照药材相应斑点。
　　2.2.3 检查
　　水分 照水分测定法（《中华人民共和国药典2005 版》附录Ⅸ H 第一法）测定。取供试品4g，平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5 小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30 分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1 小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg 为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。
　　总灰分 照灰分测定法（《中华人民共和国药典2005 版》附录Ⅸ K）测定。将供试品粉碎，使能通过二号筛，混合均匀后，取供试品2g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量（准确至0.01g），缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量（%）。
　　2.2.4 浸出物测定
　　浸出物照（《中华人民共和国药典2005 版》附录X A）醇溶性浸出物测定法项下的热浸法对供试品进行醇溶性浸出物测定。取供试品约2g，称定重量，置100ml 的锥形瓶中，精密加入乙醇100ml，塞紧，称定重量，静置1 小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞,再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 小时，置干燥器中冷却30 分钟，迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量（%）。
　　2.2.5 含量测定
　　有机酸 参照《中华人民共和国药典2005 版》山楂含量测定项下有机酸测定法对三批供试品进行测定。取本品细粉约1g，精密称定，精密加水100ml，室温下浸泡4 小时，时时振摇，滤过。精密量取续滤液25ml，加水50ml，加酚酞指示液2 滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定，即得。每1ml 氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.404mg 的枸橼酸(C6H8O7)。
　　金丝桃苷药效学筛选表明黄酮类成分为山楂发生作用的主要活性部位[10]，为了有效控制药材质量，选择金丝桃苷为指标成分，采用高效液相色谱法测定焦山楂金丝桃苷含量。
　　照高效液相色谱法（中国药典2005 年版一部附录VI D）测定。
　　色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.5％乙酸-乙腈-甲醇（79:15:6)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于3000。
　　对照品溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品适量，加流动相制成每1ml 含0.01mg 的溶液，即得。
　　检测波长的确定将金丝桃苷对照品10μl 按上述色谱条件进样，经SPD-M10vp二极管阵列检测器在190～900nm 进行紫外扫描。结果表明：金丝桃苷在360nm 处吸收度最大。
　　供试品溶液的制备取本品约1g，精密称定，加入甲醇-0.5％乙酸（4:1）的混合溶液10ml，称定重量，超声处理30 分钟，放凉，补足重量，摇匀，取续滤液离心（10000 转/分钟），即得。
　　线性关系考察取对照品溶液（20μg/ml）的溶液，分别精密吸取对照品溶液2μl、4μl、8μl、16μl、32μl注入液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标注曲线，计算得回归方程：Y=1639881.5x-452.7，r=0.9999995(X 为金丝桃苷，单位μg，Y 为峰面积)，线性范围：0.02～0.32μg。
　　精密度实验取金丝桃苷对照品溶液10μl ，注入液相色谱仪，连续进样6 次，测定峰面积，积分值计算RSD=0.8%，表明精密度良好。
　　稳定性实验取金丝桃苷对照品溶液10μl，分别在分别于0、1、2、4、8、12、18h 进样10μl，测定金丝桃苷的峰面积，结果RSD 为0.77%，表明金丝桃苷溶液在16h 内稳定。
　　重复性实验取同一批焦山楂细粉5 份，每份1g，精密称定，照“供试品溶液制备”方法平行处理5份，分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，RSD=0.84％，表明此方法重复性好。
　　加样回收实验精密称取已知含量（0.1376mg?g-1）焦山楂细粉0.5g，共6 份，精密加入金丝桃苷对照品0.6mg，照“供试品溶液制备”方法制备，分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，结果平均回收率为100.13％，RSD=1.47％。
　　样品含量测定分别精密吸取对照品溶液10μl 与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
　　
　　3 结果与讨论

经上述对本品的稳定性考察，从实验结果可以看出：1、本品常温留样考察1～12 月和加速稳定性实验1～2，各项检查项目合格；2、在常温留样考察第18 个月样品的外观、显微鉴别、薄层鉴别及浸出物检查均符合规定，但是部分样品含水量及全部样品金丝桃苷和有机酸含量已不符合规定；3、在加速稳定实验第3 个月，样品的外观、显微鉴别、薄层鉴别、浸出物及有机酸含量检查均符合规定，但部分样品含水量及全部样品金丝桃苷含量已不符合规定。
　　目前，各相关标准中没有关于中药材及中药饮片储存条件及保质期的具体规定，在药材运输、储存及使用等过程中存在储存条件不当、药材变质等现象，导致在中药实际用药中疗效下降达不到治疗要求等现象。本次试验通过对水分、浸出物、有机酸及金丝桃苷等的测定来控制、评价焦山楂质量，为以后进一步研究焦山楂稳定性及储存条件提供了参考，为规范中药材用药、保证质量奠定了基础。

　[参考文献]
　　[1]李家实.《中药鉴定学》[M],上海：上海科学技术出版社,2006：389-391
　　[2]李义奎.《中药药理学》[M],北京：中国中医药出版社,1992：126-126．
　　[3]唐廷猷.《中药炮制学》[M],北京：中国医药科技出版社,1997：90
　　[4]中华人民共和国卫生部药典委员会.《中国药典2005 年版》一部[M].人民卫生出版社
　　[5]孙波.山楂的现代药理与临床应用分析.中国医药指南[J].2009,12(7):122—123