肾炎防衰液对UUO大鼠肾组织TGF-β1 和Smad7表达的影响

　　0 引言
　　
　　肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis, RIF )是各种肾脏疾病进入终末期的进行性、不可逆的共同病理损害，并被认为比肾小球病变更能预示慢性肾衰竭的进展速率及预后。TGF-β/Smad 信号通路是目前公认的肾纤维化主要的最终共同路径之一[1] 。目前普遍认为转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β1)在肾脏纤维化的发病机制中起着重要作用，是纤维化过程中始发的致纤维化因子。smad7 是逆向调控因子，对TGF-β1 起到负反馈调节作用[2]。肾炎防衰液是根据消?散结法而立的，经临床验证可以改善慢性肾炎患者临床症状，减少尿蛋白，改善肾功能 [3],前期对肾间质纤维化的研究发现肾炎防衰液可减少UUO 大鼠肾组织炎细胞浸润，使主要的细胞因子TGF-β1 分泌减少或者活性降低，减少可以表达α-SMA 的细胞的生成[4]。在对5/6 肾切除大鼠肾小球硬化的研究中初步发现, 肾炎防衰液可明显降低5/6 肾切除大鼠血肌酐和尿素氮，明显降低肾小球中纤连蛋白的堆聚，抑制了细胞外基质生成或积聚的始动因素，而发挥拮抗肾小球硬化的作用[5]。为了进一步探讨肾炎防衰液抗肾间质纤维化的疗效机制，本文将探讨肾炎防衰液对肾间质纤维化大鼠模型肾组织TGF-β/Smad 通路的影响,以进一步阐明肾炎防衰液对肾间质纤维化肾脏的保护作用的机制。
　　
　　1 实验材料
　　
　　1.1 实验动物
　　健康雄性SD 大鼠112 只,体重(200±20)g ,北京维通利华实验动物技术有限公司提供（许可证编号：SCXK(京)2006-009）。
　　
　　1.2 实验药品
　　肾炎防衰液由生黄芪30g，当归10g，熟大黄5g，莪术10g，穿山甲10g、海藻10g 等组成，经醇提制成，每1mL 含生药2g，由北京中医药大学中药学院制剂室制备。批号20090509。盐酸贝那普利，由北京诺华制药有限公司生产，H20030514，规格10mg/片。
　　
　　1.3 实验试剂
　　TGF-β1 (兔抗鼠多克隆抗体, bs-0103R) 、Smad7 (兔抗鼠多克隆抗体, bs-0566R)、SP 免疫组织化学试剂盒,均购自北京博奥森生物技术有限公司。DAB 显色剂, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
　　
　　2 实验方法
　　
　　2.1 模型制作
　　参照文献[6] 假手术组大鼠仅游离左输尿管,但不予结扎。
　　
　　2.2 分组及用药
　　正常组15 只；假手术组16 只；模型组16 只；贝那普利组16 只；肾炎防衰液小、中、大剂量组各16 只；药物组灌胃给药，其余各组给予等量生理盐水。小、中、大剂量大鼠用量分别为人用量单位体重的3.5、7、14 倍（6.7g/kg、13.4g/kg 、26.8g/kg）。贝那普利组给予苯那普利为人用量单位体重的7 倍（2.331mg/kg）。灌胃每天一次，自由饮水及普通饲料，用药4 周。
　　取左侧肾组织,纵切后取1/4 以10 %中性福尔马林固定，脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋后,切片，厚度约5μm。
　　
　　2.3 肾脏病理学检查
　　Masson 染色步骤 切片脱蜡至水；苦味酸二次固定（1h）；地衣红(45min)；丽春红酸性品红溶液染(1 min)；0.2%醋酸水溶液洗(30sec) ；1%磷钼酸分化 (5min)；亮绿液染(3min)；脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光学显微镜下观察肾间质病理变化。
　　
　　2.4 肾组织中TGF-β1、Smad7 的免疫组化
　　按免疫组化试剂盒说明操作。TGF-β1、Smad7 浓度均为1:2002.5 肾组织图像分析每张切片随机选取至少5 个视野,采用日本OLYMPUS CX21 倒置生物显微镜采集图像,并用Image-Pro Plus 软件进行图像对结果进行分析, 阳性细胞内的染色量化为综合面积和灰度值所得出的积分光密度值(OD 值), 取均值。
　　
　　2.6 统计学方法
　　所有数据采用SPSS 16.0 软件处理, 结果均以均数±标准差表示, 组间比较采用方差分析。两两比较采用LSD 法。
　　
　　3 结果
　　
　　3.1 肾脏病理改变
　　Masson 染色：
　　正常组和假手术组大鼠肾组织未见明显异常。模型组大鼠于术后第二周出现肾间质炎症细胞浸润,成纤维细胞局灶出现,肾小管局灶性萎缩或扩张，间质灶性纤维化。各治疗组和贝那普利组肾间质纤维化面积较模型组明显减少( P<0.01) 。
　　术后第四周模型组大鼠病变进一步加重，肾小管上皮细胞萎缩，大部分肾小管管腔扩张，有些肾小管断裂,间质纤维组织增生, 大量炎性细胞浸润。与同期正常组和假手术组相比差异明显(P<0.01)。各治疗组和贝那普利组与同期模型组相比，肾小管扩张、肾间质增宽程度及肾小管间质的纤维化程度均有明显下降(P<0.01)，但仍高于同期正常组和假手术组(P<0.01)。大、中、小各组比较，其中肾炎防衰液中剂量组病变最轻，但无统计学意义。
　　
　　3.2 半定量免疫组织化学检测结果
　　3.2.1 TGF-β1 表达的动态变化
　　术后第二周,正常组、假手术组大鼠肾组织少量TGF-β1 表达,主要在肾小管上皮细胞胞浆中表达,肾间质、肾小球微量表达。模型组表达较正常组、假手术组明显增多，随着梗阻时间的延长，TGF-β1 增多更为明显。与同期正常组、假手术组比较差异明显( P<0.01)。随着时间延长，治疗组和贝那普利组TGF-β1 的表达也逐渐增多，但较同一时点模型组的TGFβ1 表达降低( P<0.05)。
　　3.2.2 Smad7 表达的动态变化
　　术后第二周正常组、假手术组Smad7 主要在肾小管上皮细胞胞浆中表达,肾小球微量表达。模型组Smad7 主要在肾小管上皮细胞胞浆中表达，随着梗阻时间的延长，减少更为明显，与同期正常组、假手术组比较表达明显减少( P<0.05)。术后第二周和术后第四周,治疗组和贝那普利组Smad7 表达均较模型组显著增多(P< 0.05) .
　　
　　4 讨论
　　
　　肾间质纤维化是多种临床和实验性肾病进展的共同转归, 是肾功能衰竭的主要病理基础。TGF-β1 是目前公认作用最强的致纤维化细胞因子之一, TGF-β1 过度表达可导致肾小球硬化及肾间质纤维化[7,8]
　　TGF-β1 通过复杂的细胞内信号系统及其相互作用介导肾小管上皮细胞转分化,在这些信号通路中,smad 信号通路是最为重要的一条[9、10] , TGF-β1 与TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ) 结合后,联合并磷酸化TGF-βⅠ型受体( TβRⅠ) ,TβRⅠ再磷酸化smad2 和smad3 (受体调节型smads 即R-smads) ,磷酸化的R-smads 随后与smad4(共同通道型Smad 即Co-smad)一同进入细胞核,与特异的DNA结合蛋白结合,调节靶基因的转录最终引起ECM生成增多及降解减少,从而引起器官纤维化。smad7 是TGF-β/smad 信号通路中的逆向调控因子,可通过与磷酸化的smad2/3 结合或与活化的受体结合,直接或间接地减少smad2 /3 的活化,从而阻断TGF-β/smad 通路信号转导,抑制肾间质纤维化的进展[11]。
　　本研究所用药物肾炎防衰液是根据消?散结法而立的，主要成分是海藻、牡蛎、穿山甲、黄芪、当归、熟地、熟大黄等。海藻、牡蛎、穿山甲、熟大黄消?散结，黄芪、当归、熟地扶正活络。我们在前期的研究中初步发现, 肾炎防衰液可明显降低5/6 肾切除大鼠血肌酐和尿素氮,明显降低肾小球中纤连蛋白的堆聚，抑制了ECM 生成或积聚的始动因素，而发挥拮抗肾小球硬化的作用[5]。本实验用观察肾小管和肾间质纤维化的经典UUO 动物模型，以临床广泛应用于肾脏疾病且实验证实能有效缓解UUO 所致肾脏损害的血管紧张素转换酶受体抑制剂[12]贝纳普利作为阳性药贝那普利, 来研究肾炎防衰液对肾间质纤维化的作用及其机制。
　　本实验中结果显示,UUO 模型大鼠肾组织中smad7 蛋白表达较正常组和假手术组显著下调, TGF-β1 蛋白表达显著上调,表明存在smad 信号通路分子的活化，肾炎防衰液各治疗组TGF-β1 的表达均显著低于模型组,smad7 的表达均显著高于模型组, 说明肾炎防衰液可能通过抑制TGF-β1 的表达,增强smad7 的表达,从而抑制肾小管上皮细胞转分化,减少ECM 的生成,减轻肾间质纤维化。各组中以中剂量组效果最好，这可能是因为大剂量药物浓缩粘稠灌胃时吸收度不好而不能发挥较好的疗效。
　　综上所述, 肾炎防衰液对肾间质纤维化大鼠肾脏的保护作用与其对TGF-β1/smad 通路的调节作用相关，肾炎防衰液可通过下调TGF-β1 的表达,上调smad7 的表达,干预细胞内信号转导途径,从而抑制间质胶原积聚,改善肾间质纤维化,延缓肾间质纤维化的进程。

　　
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