RNAi抑制NEK293细胞TGFβ1表达的研究
【摘要】 目的: 探讨针对转化生长因子β1(TGFβ1)的小干扰RNA(siRNA)对大鼠肾间质细胞系(NEK293)TGFβ1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用. 方法: 利用RNA干扰(RNAi)效应设计针对TGFβ1的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系. RTPCR和Western Blot分别检测TGFβ1 mRNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化. 另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照. 结果: siRNA转染效率70,特异性siRNA对TGFβ1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05). 结论: 应用RNAi技术可明显抑制TGFβ1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.【关键词】 转化生长因子β1;肾纤维化;RNA干扰
0引言
肾纤维化是肾脏多种损伤,如创伤、缺血、肾移植术后慢性排异反应及尿路梗阻等修复的共同转归. 长期以来,肾纤维化被描述为不可逆的静止性瘢痕组织,但近年来的研究认为纤维化实际上是一个动态过程,其特征为细胞外基质(ECM)迅速重建和长期的成纤维细胞激活[1],已知的主要效应细胞为成纤维细胞、肾间质细胞等. 体外研究[2]表明,转化生长因子β1(TGFβ1)是肾间质细胞的主要调控因子. 本研究应用TGFβ1特异性小干扰RNA(siRNA), 以质粒载体转染大鼠肾间质细胞NEK293,观察特异性siRNA对TGFβ1的表达,NEK293细胞周期及凋亡的影响.
1材料和方法
1.1材料HEK293细胞(美国Clontech公司);Lipofectamine(美国Gibco公司);RTPCR 试剂盒(日本TaKaRa 公司);化学发光试剂,(美国Santa Cruz公司);噻唑蓝显色剂(MTT)、碘化丙啶(PI)荧光染料、TritonX100打孔剂(美国Sigma公司);DOSPER脂质体(美国Roche公司);荧光显微镜(德国Opton公司);TECAN sunrise型自动酶联免疫检测仪,coulter Epics XL流式细胞仪,LS6500液闪计数仪(美国Beckman公司).
1.2方法
1.2.1特异性siRNA设计及载体的构建候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,去掉与人类RNAs同源性的靶序列,最后选取3个siRNA. 根据pSilencer3.1H1质粒载体使用说明,将编码siRNA的双链互补DNA片段插入该载体的BamHI/HindⅢ位点之间以制备发夹cDNAs[3]. 表达这3种siRNA的重组质粒分别命名为psiRNA1,2,3. 以BamHI和HindⅢ酶切后电泳观察酶切特异性片段的大小,并对纯化的siRNA片段进行DNA测序分析. 另合成一不针对任何基因的无意义片段作为对照.
1.2.2细胞培养及转染HEK293细胞以含100 mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液,于37℃,50 mL/L CO2,饱和湿度培养,2 d换液1次. 取对数生长期细胞进行实验. 按lipofectamineTM2000脂质体转染法,将5 μg psiRNA(13)和无意义对照质粒转染到HEK293细胞中,6 h后更换正常培养基,12 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率.
1.2.3RTPCR检测psiRNA1,2,3三个实验组及对照组分别收集细胞(细胞总数为1×107个)按Trizol试剂操作步骤提取总RNA,选用一步法RTPCR试剂盒. 具体参数及条件根据引物的Tm值和扩增片断的大小进行调整.
1.2.4Western Blot检测收集各组细胞并以PBS洗涤及细胞裂解液裂解,提取总蛋白,电泳及转膜后进行常规免疫反应,显影、定影后将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值.
1.2.5MTT比色实验1×104 HEK293细胞接种于96孔培养板, 37℃,50 mL/L CO2,饱和湿度培养1 d. 按实验要求分别在细胞中加入终浓度为200 nmol/L的siRNA,中止培养4 h前加入MTT,应用酶标仪进行检测. 检测490 nm波长处的吸光度A值,计算细胞增殖抑制率:增殖抑制率() = (1-A实验组/A对照组) ×100.
1.2.6细胞凋亡检测3 mL培养液含5×105细胞培养于6孔板,用预冷的700 mg/L乙醇固定,4℃过夜,PI(50 mg/L)染色,分析亚二倍体峰. 调整细胞密度为5 ×106/mL,取1 mL细胞悬液,1000 r/min 4℃离心10 min,重复2次,将细胞重悬于200 μL结合缓冲液,加入10 μL膜连蛋白Ⅴ (Annexin V2F ITC)和5 μL碘化丙锭(PI) ,避光室温反应15 min,加入300 μL结合缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.
1.2.7转染效率的检测试剂盒中提供带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照用以监测转染效率. 按说明书转染, 24 h后收集细胞, PBS洗涤后固定在20 g/L多聚甲醛中,流式细胞仪检测.
统计学处理: 以SPSS11.0软件进行分析. 组间差异比较采用方差分析及LSDt检验,P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1siRNA转染效率流式细胞分析显示,几乎所有的细胞都摄取了GFP的绿色荧光. 由于siRNA分子远小于质粒分子,故转染siRNA时转染效率应大于70(图1).
A: siRNA1组; B: siRNA2组; C: siRNA3组.
图1各实验组siRNA表达载体转染×200(略)
2.2TGFβ1 mRNA及蛋白的表达特异性siRNA处理后24 h TGFβ1 mRNA表达水平明显降低,与非特异性siRNA组mRNA的表达水平相比较有显着差异(表1,图2). 特异性siRNA转染24 h TGFβ1蛋白表达水平明显下调,与非特异性siRNA转染组比较差异有统计学意义,TGFβ1 mRNA及蛋白表达在实验组间无显着差异(表1,图3).
表1脂质体介导的siRNA表达载体转染24 h后对TGFβ1表达的影响(略)
aP<0.05 vs 阴性siRNA对照和阳性siRNA对照.
A: 非特异性siRNA对照; B: 特异性TGFbeta siRNA1; C: 特异性TGFbeta siRNA2; D: 特异性TGFbeta siRNA3; M: DNA marker.
图2RTPCR检测TGFβ1 siRNA转染后TGFβ1 mRNA表达(略)
A: 阴性siRNA对照; B: 阳性GAPDH siRNA对照; C: 特异性TGFbeta siRNA1; D: 特异性TGFbeta siRNA2; E: 特异性TGFbeta siRNA3.
图3Western Blot检测TGFβ1 siRNA转染后TGFβ1蛋白表达(略)
2.3特异性siRNA抑制细胞增殖特异性siRNA转染HEK293细胞24 h后,细胞增殖平均抑制率与非特异性siRNA转染细胞组相比细胞增殖抑制明显增强(P<0.05,表2).
表2特异性siRNA转染HEK293细胞24 h后对细胞凋亡和增殖的影响(略)
aP<0.05 vs 阴性siRNA对照+lipo.
3讨论
TGFβ1的纯化始于上世纪70年代末,是多功能生长因子的原型[4]. 纤维化的肾组织有较强TGFβ1表达,并与纤维化的程度相关[5],来自大鼠及人的成纤维细胞在经过TGFβ1处理后都显示出Ⅰ型胶原和纤维蛋白合成增加.
Fire等[6]发现RNA分子操纵着许多细胞功能,可通过互补序列与DNA结合,从而关闭或降解已表达的基因. 通过逆转录病毒表达载体,在人肿瘤细胞特异性抑癌基因KRAS V12,可以导致非依赖生长和成瘤性的丧失[7]. HIV1 ref mRNA依赖siRNA的有效降解在HIV1前体蛋白和产生siRNA的结构共转染的细胞中获得[8]. 本研究根据siRNA序列设计原则,候选siRNA序列通过BLAST工具搜索,选取3个针对TGFβ1的siRNA表达载体经转染入HEK293细胞后,均起到RNA干扰的作用,对TGFβ1 mRNA和蛋白以及下游信号蛋白的活化水平都能明显抑制,明显下调细胞增殖并诱导细胞凋亡.
针对每个基因需要设计并检测多个siRNA序列,由于每一siRNA序列在与mRNA结合过程中,发挥降解作用的效率不同. 因此,根据RNAi设计原理一般设计3个位于不同位置RNAi序列,进行载体构建,细胞转染,功能鉴定等. 3个RNAi序列均有RNA沉默的效果,只是效率不同,在转染入细胞后根据RTPCR或Northern杂交检测mRNA表达,用Western杂交检测相应蛋白表达,才能确定RNAi的效果[9].
由于mRNA的二级结构及作用机制尚不完全清楚,如果可能,siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计[10]. 本研究采用的RNAi序列在实验中显示出较高的抑制率,为肾纤维化的治疗提供了实验基础.
【参考文献】
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