小议高产酒精酵母菌的紫外线诱变选育
聂世现，王钰，黄文静，季必霞
0 引言
石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。
为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。
1.1.2 培养基
麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。
YPD培养基(g/L)：
液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。
固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。
原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。
以上培养基于115℃灭菌20min。
TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。
TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。
1.1.3 试剂
缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。
预处理剂：0.1%β-巯基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-Na2。
稳渗剂：KC1高渗缓冲液：缓冲液中添加KC1至0.7mol/L；山梨醇高渗缓冲液：缓冲液中添加山梨醇至0.8mol/L；甘露醇高渗缓冲液：缓冲液中添加甘露醇至0.8mol/L；蔗糖高渗缓冲液：缓冲液中加入17%的蔗糖。
酶液：分别将1%，1.5%，2%，2.5%的蜗牛酶和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶溶于高渗缓冲液中，微孔滤膜过滤除菌，制备成不同浓度的酶液。酶购于上海生工。
1.2 方法
1.2.1 出发菌株的原生质体制备与再生
1.2.1.1 出发菌株生长曲线的测定
挑取斜面菌株1～2环接种于50mLYPD液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h后分别以1:100的量接种于装有10mLYPD液体培养基的大试管中，28℃，200r/min摇床培养，每隔2h取出一支试管，测定其OD600值，绘制其生长曲线。
1.2.1.2 出发菌株原生质体制备与再生
将活化好的菌种接种于盛有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min摇床培养，当其进入对数生长期时，取5mL菌液3500r/min离心5min，用磷酸-柠檬酸缓冲液洗2次，无菌加入0.1%β-巯基乙醇，28℃静置10min，用高渗缓冲液洗涤3次，取1mL用无菌水稀释到10-4，取100μL涂YPD平板得“总菌落数（A）”，再取1mL菌液离心弃上清液，加入酶液，30℃水浴，2000r/min离心10min，高渗缓冲液洗涤2次后稀释至10-4，分别取100μL涂YPD平板和原生质体再生平板得“未形成原生质体的菌落数（B）”和“酶处理后未形成原生质体的菌落数和原生质体再生的菌落数之和（C）”。
1.2.1.3 原生质体形成率与再生率的计算
原生质体形成率（%）=（A-B）/A×100%原生质体再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%1.2.1.4单因素对原生质体制备与再生的影响
（1）菌龄活化菌种接种于YPD液体培养基中分别培养6h，8h，10h，12h和14h，用1%的蜗牛酶液30℃酶解2h，采用蔗糖高渗缓冲液和蔗糖再生培养基，计算原生质体形成率和再生率。
（2）酶种类和浓度活化菌种接种于YPD液体培养基中培养10h，用1%，1.5%,2%,2.5%的蜗牛酶液和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶液，30℃酶解2h，采用蔗糖高渗缓冲液和蔗糖再生培养基，计算原生质体形成率和再生率。
（3）酶处理时间活化菌种接种于YPD液体培养基中培养10h，用1%的蜗牛酶液30℃酶解0.5h，1h，1.5h，2h和2.5h，采用蔗糖高渗缓冲液和蔗糖再生培养基，计算原生质体形成率和再生率。
（4）稳渗剂活化菌种接种于YPD液体培养基中培养10h，用1%的蜗牛酶液30℃酶解2h，稳渗剂分别采用0.7mol/LKC1，0.8mol/L山梨醇，0.8mol/L甘露醇和17%蔗糖高渗缓冲液，再生培养基分别采用KCl，山梨醇，甘露醇和蔗糖再生培养基，计算原生质体形成率和再生率。
1.2.2 原生质体紫外诱变
取稀释至10-4后的原生质体悬液5mL于无菌平皿中，置于20W紫外灯下距离30cm照射不同时间后涂布于高渗平板和普通平板，同时作对照组，于28℃避光培养72h，待长出菌落后计算其存活率。
1.2.3 酵母菌的筛选
1.2.3.1 一级筛选
TTC平板法：将诱变后的再生菌株接入含TTC下层培养基的平皿中培养，长出菌落后倒入TTC上层培养基，28℃避光保存2h～3h。比较各菌株之间的产酒精能力。初筛性状优良的酵母菌株。
1.2.3.2 二级筛选
耐酒精性测定：将菌株活化接入YPD液体培养基，经28℃，200r/min摇床培养24h后，以1%的接种量接入含10%酒精的无菌麦芽汁液体培养基试管中（内含杜氏管），于30℃恒温静止培养，观察产气情况，产气时间早、速度快、产气量大的菌株较耐酒精。
1.2.3.3 三级筛选
麦芽汁发酵法：无菌条件下挑取一环筛选出的菌株接种于50mLYPD培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h，以5%的量接入装有200mL麦芽汁的锥形瓶中，30℃培养，每12h称重一次，记录失重量，72h后测定成熟发酵液中酒精度和残还原糖含量。筛选性状优良的菌株。
1.2.4 发酵液的检测方法
酒精浓度测定：蒸馏法。
还原糖测定：DNS法。
CO2失重的测定：直接称重法。
1.2.5 遗传稳定性实验
鉴于诱变菌株的性状常不稳定，连续继代培养时可能出现退化现象。为了检测正突变菌株遗传性状是否稳定，将正突变菌株传代培养10代，测定其酒精产量。
2 结果与讨论
2.1 A4原生质体的制备与再生
2.1.1 A4的生长曲线通过对不同时间OD600值的测定，可得到出发菌株的生长曲线。
可知A4的对数生长期是6h～12h，从14h进入稳定期，细胞在对数生长期生长较快，代谢旺盛，细胞壁对酶较敏感，在此时期制备原生质体效果较好。
2.1.2 菌龄对原生质体制备与再生的影响
活化后的菌种于YPD液体培养基中培养不同时间，菌龄以对数生长中期（8h～10h）为宜。低于8h虽然原生质体形成率较高，但再生率很低，14h后菌体进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，对酶的敏感性下降，不易形成原生质体，原生质体形成率明显降低，再生率也有所下降。
2.1.3 酶种类和浓度对原生质体制备与再生的影响
通过不同浓度的蜗牛酶液和混合酶液（0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶）对A4进行酶解。原生质体形成率随酶浓度增加而增加，当蜗牛酶浓度达到1.5%时，原生质体形成率达85%以上，此时原生质体再生率达到最高35%，但随酶浓度的增加再生率逐渐降低。分析原因可能是蜗牛酶中含有对原生质体有害的杂酶，杂酶浓度随蜗牛酶浓度的增加而增加，当达到一定浓度后影响了原生质体的活性；另一方面，由于酶浓度的增加会使细胞脱壁过于彻底致使再生时细胞壁合成的引物受破坏。有报道单一酶的作用效果不如混合酶，使用混合酶，原生质体形成率较低，虽然再生率比高浓度蜗牛酶略高，但仍比经1.5%的蜗牛酶处理的原生质体再生率低。
2.1.4 酶解时间对原生质体制备与再生的影响
合适的酶解时间对原生质体的制备与再生至关重要，对A4进行不同时间的酶解，原生质体形成率随酶解时间增加而增加；1h时原生质体再生率达到最高31.25%，随酶解时间增加再生率逐渐降低。分析原因可能是酶液中含有一些蛋白酶，酶解时间过长会对一些早期释放的原生质体膜造成损坏，从而导致原生质体破裂。以形成率与再生率的乘积作为选择指标，酶处理1.5h为最佳酶解时间。
2.1.5 稳渗剂对原生质体制备与再生的影响
原生质体对渗透压非常敏感，所以稳渗剂对原生质体制备起非常重要的作用。在对A4原生质体制备与再生实验中，分别选用0.7mol/LKC1，0.8mol/L山梨醇，0.8mol/L甘露醇和17%蔗糖高渗缓冲液为稳渗剂。
以0.7mol/LKC1高渗缓冲液为稳渗剂，原生质体形成率和再生率都较高，再生率达最高31.82%；以0.8mol/L山梨醇高渗缓冲液为稳渗剂，原生质体形成率最高，达59.86%，但是再生率最低；以17%蔗糖为稳渗剂，形成率最低，但再生率较高，可能由于蔗糖不仅可以作高渗缓冲液稳定渗透压，同样是种能被酵母利用的碳源，对酵母细胞起到一定的保护作用，使酵母细胞可以较快恢复生长。
2.2 酵母菌的筛选
2.2.1 一级筛选
原生质体悬液经紫外灯（20W）不同时间照射诱变处理后，涂布于再生培养基培养。将诱变后的再生菌落用TTC平板法进行一级筛选。TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是一种显色剂，它能对酵母的代谢产物发生呈色反应，根据颜色深浅判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低。将酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂，产酒精能力强的酵母菌落呈深红色，次之为粉红色，微红色或不显色。以出发菌株为对照，显色后颜色比出发菌株深者为正突变。可看出经30s和40s照射处理的效果较好，共得到32株酵母菌，随机编号为A4-1～A4-32，转斜面保存作为二级筛选的出发菌株。
2.2.2二级筛选
在酒精发酵时，产物酒精的浓度过高会对酵母造成一定的毒害作用，抑制酵母的生长及发酵活性。所以，酵母的发酵能力在很大程度上取决于它们自身酒精耐受力的大小。本实验通过杜氏管发酵，测定酵母菌在外加10%酒精的发酵液中的产气速度和产气量。若无气泡产生表示无发酵现象，说明菌株不耐10%的酒精；若有气泡产生表示有发酵现象，气泡产生的早晚、产气速度和产气量多少反应菌株耐酒精的程度。对不同酵母菌株的酒精耐性进行比较，结果见表2。
由表2可看出，A4-5，A4-8，A4-9，A4-10，A4-18，A4-19，A4-20，A4-23，A4-24和A4-25，产气时间较早，速度较快，产气量较多，将其选出作为三级筛选的出发菌株。
2.2.3 三级筛选
将二级筛选出的10株突变菌株活化后接种于麦芽汁发酵培养基中，在30℃进行发酵实验（重复三次），发酵终止测酒精产量和发酵液的残糖量。
A4-9，A4-18，A4-19，A4-20，A4-24突变菌株酒精产率明显增加，A4-20尤为明显酒精产率达到4.93%，残糖量较低，CO2失重量最大。CO2释放量与出酒精率有很大关系，总失重值愈大，产酒精量愈多。A4-10，A4-23和A4-25突变株酒精产率没有增加，甚至降低。这可能是不同酵母菌株的生长代谢过程有差异，对可发酵性糖的利用方式有区别，这3株菌可能更多的是利用发酵性糖进行细胞的生长繁殖，从而减少发酵性糖转化为酒精的量。另外，这3株酵母菌发酵糖产酒精的稳定性较差。
2.2.4 遗传稳定性实验
将A4-20连续传代10次，测定其发酵酒精产率，并与初代进行比较。经测定，初代酒精度为4.9%，第10代酒精度为4.8%。结果表明A4-20的发酵性能无明显变化，表现稳定，酒精产率稳定在4.9%左右。
3 结论
本实验对A4进行了原生质体制备与再生条件的研究，用紫外线进行原生质体诱变选育。
实验表明，A4原生质体最佳制备与再生条件：菌龄为10h、酶用量为1.5%的蜗牛酶、酶解时间为1.5h、渗稳剂选用0.7mol/LKC1。通过紫外线诱变A4原生质体筛选出发酵性能稳定的突变菌株A4-20，发酵麦芽汁72h，酒精产率4.93%，比出发菌株的酒精产率提高了28.7%。
但是本实验也存在一定不足，如筛选过程中只对麦芽汁进行发酵实验而未对甘薯淀粉进行发酵实验。为进一步提高酒精产率，我们将以诱变得到的高产菌株作为出发菌株，以高产淀粉品种甘薯为原材料，对发酵条件进行进一步的研究。