补肾健脾活血方对兔胫骨应力性损伤的防治作用

作者：陈佑学, 李国平, 姚鸿恩, 李肃反, 段立功    作者单位：1. 首都体育学院理论学科部保健康复教研室, 北京 100088 　2. 国家体育总局运动医学研究所体育医院创伤外科, 北京 100061
【摘要】  目的：探讨补肾健脾活血方对兔胫骨应力性损伤的防治作用。方法：雄性成年兔35只，随机分为安静对照组、跑跳运动1周组、跑跳运动2周组、跑跳运动3周组、跑跳运动4周组、服药1周运动组和服药2周运动组，每组各5只。采用自制高电压、低电流刺激仪刺激实验兔进行被动跑跳运动。观测实验兔胫骨X线表现、核素骨显像、组织学与电镜变化，采用放射免疫法检测血清甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)、骨钙素(bone Gla protein, BGP)和睾酮的含量。结果：持续刺激2周后，骨细胞呈现应力性损伤的趋势，血BGP和血PTH均显著升高，血睾酮显著降低。持续刺激3～4周后，X线及核素骨显像均表现阳性，组织学及血生化出现应力性损伤的变化。两服药组X线及核素骨显像均呈阴性，皮质内出现新生骨，骨细胞具有较典型的成骨相，血PTH呈下降趋势，血BGP和血睾酮水平均显著高于同周运动组。结论：补肾健脾活血方药具有明显刺激新骨形成，提高血睾酮水平的作用，对胫骨应力性损伤起到较好的防治作用。

【关键词】  胫骨; 补肾药; 骨重建; 细胞结构; 生化标记; 兔

Bushen Jianpi Huoxue Recipe in prevention and treatment of tibial stress injuries in rabbits

　　Youxue CHEN1, Guoping LI2, Hongen YAO1, Sufan LI2, Ligong DUAN2

　　1. Research Unit of Health Rehabilitation, Department of Basic Theory, Capital College of Physical Education, Beijing 100088, China

　　2. Department of Traumatic Surgery, Beijing Sports Hospital, National Research Institute of Sports Medicine, Beijing 100061, China

　　Objective: To explore the effects of Bushen Jianpi Huoxue Recipe, a compound traditional Chinese herbal medicine for tonifying the kidney, invigorating the spleen and promoting blood circulation, on tibial stress injuries in rabbits.

　　Methods: Thirtyfive mature male rabbits were used in the experiment, and randomly divided into 7 groups: sedentary control (SC) group, 1week exercise (E1W) group, 2week exercise (E2W) group, 3week exercise (E3W) group, 4week exercise (E4W) group, 3week exercise and 1week Chinese herbal medicine treatment (EMT1W) group, and 4week exercise and 2week Chinese herbal medicine treatment (EMT2W) group. There were 5 rabbits in each group. A rabbit model of tibial stress injuries was established by stimulating the rabbits to jump and run within a highvoltage and lowcurrent electronic cage. Radiologic features, bone scintigraphy, histology and electron microscopy of rabbit tibia were observed, and the content of blood parathyroid hormone (PTH), bone gla protein (BGP) and testosterone was detected by using radioimmunoassay method.

　　Results: After 2week exercise, changes in histology and osteocytes had a tendency towards stress injuries. Serum PTH and BGP levels were remarkably increased, while serum testosterone level was lower than that in the SC group. Three and fourweek continuous exercise resulted in tibial stress injuries, and the positive changes were observed in Xray features and radionuclide images. Compared with E3W group, the levels of serum BGP and testosterone were decreased remarkably. A series of positive results such as prevailing negativeness of Xray features and radionuclide images, increasing process of osteogenesis, typical osteogenic phase of osteocytes and favorable transformation of biochemical markers was shown in EMT1W and EMT2W groups. It also showed remarkable rising levels of serum BGP and testosterone and remarkable reducing level of serum PTH in EMT1W and EMT2W groups as compared with E1W and E2W groups.

　　Conclusion: Bushen Jianpi Huoxue Recipe can prevent and treat exerciseinduced tibial stress injuries by stimulating new bone formation and increasing serum testosterone level.

　　Keywords: tibial; kidneyreinforcing drugs; bone remodeling; cellular structure; biochemical markers; rabbits

　　骨骼在持续性高强度应力作用下，往往会受到应力性损伤，这些损伤多见于运动员、新兵训练人员及部分骨折愈合初期局部形成的应力集中状态[1，2]，预防和治疗骨骼的应力性损伤在临床具有重要意义。本研究根据中医“肾主骨”、“脾主肌肉”及气血理论，探讨补肾健脾活血方对兔胫骨持续应力性损伤的保护作用及其机制，为临床实践提供必要的理论和应用依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物 青紫蓝兔35只，雄性，6～7月龄，体质量(3.8±0.2)kg，由北京富豪实验动物养殖中心提供。动物合格证号：SCXK(京)20050009。将35只实验兔随机分为7组：安静对照组(sedentary control, SC)、跑跳运动1周组(1week exercise, E1W)、跑跳运动2周组(2week exercise, E2W)、跑跳运动3周组(3week exercise, E3W)、跑跳运动4周组(4week exercise, E4W)、服药1周运动组(跑跳运动3周，从第3周开始，服药1周)(3week exercise and 1week Chinese herbal medicine treatment, EMT1W)、服药2周运动组(跑跳运动4周，从第3周开始，服药2周)(4week exercise and 2week Chinese herbal medicine treatment, EMT2W)。每组动物均为5只。

　　1.1.2 药物、主要试剂与仪器 补肾健脾活血方主要由熟地、杜仲、黄芪、白术、牛膝、当归等10味药物组成。将中药制成水煎剂，浓缩，相当于生药量0.5 g/ml。核素锝99亚甲基二膦酸钠(technetium [99Tc] methylene diphosphonate injection, 99TcMDP)由中国原子能科学研究院同位素室提供。APEX SOX6HR型核素扫描仪(Elscint公司)，JEM200EX型电子显微镜(JEOL公司)。

　　1.1.3 实验兔运动应力刺激动物模型的建立 参考文献[3]建立应力刺激动物模型。采用自制高电压(15 kV)、低电流(100～200 mA)动物刺激仪刺激实验兔，使其进行被动跑跳运动。每天运动45 min，分3次进行，每次15 min，中间休息15 min，每周运动5 d。最长运动周期为4周，运动结束时取材。服药组于运动第3周时开始服药，分别于服药1、2周后取材。用50 ml注射器抽取药液，按10 ml/kg计算，经动物口腔将药液直接缓慢推注入胃内。服药组每只动物每天服药1次。为使实验条件对等，E3W组和E4W组动物按照同样方法灌服等量蒸馏水。

　　1.2 观察指标和方法

　　1.2.1 X线及核素骨显像检查 所有动物在运动及处死前均摄取双下肢正侧位X线片，并作核素骨显像检查，观察胫骨变化。实验兔胫骨核素骨显像测定采用Elscint公司的APEX SOX6HR型核素扫描仪。每只动物沿耳缘静脉注射7 mCi(合259 MBq)99mTcMDP。注射7 h后分别进行静态和全身采集，其中静态采集运用距阵256×256，采集100 K;全身扫描速度设置30 cm/min，长度100 cm，距阵512×512。胫骨核素骨显像异常变化的诊断方法详见文献[3]。

　　1.2.2 血清指标测定 血清制备：动物处死前，抽取耳静脉血约4 ml，室温下放置1 h后，以2 000 r/min离心15～20 min，取上部血清放入冰箱中-18 ℃保存，待测。采用放射免疫法测定甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)、骨钙素(bone gla protein, BGP)和睾酮含量。3种免疫试剂盒均由中国原子能科学研究院同位素室提供，并按照说明书操作。

　　1.2.3 组织学及电镜观察 严格按照动物分组，定时进行取材。取材前以核素骨显像显示异常侧胫骨为取材侧，若无异常则随机取一侧胫骨。用20 %乌拉坦沿兔耳缘静脉缓慢注射麻醉动物。胫骨取出后依据核素骨显像的情况，用骨锯将胫骨锯成两段。从上下两端各取一块约0.5 cm长的骨片，迅速放入编号的盛有2.5 %戊二醛的小瓶中固定，以作电镜标本之用。剩下的两大块胫骨也编号后放入10 %甲醛钙液中固定，用于组织学切片。组织学标本染色分别采用HE和VG染色。采用Leica Q550MW图像分析系统对HE染色切片进行定量分析，测量骨皮质吸收腔面积。测量时均取横切切片，每组随机取5张，每张随机取3个视野，进行面积测定。电镜标本染色采用铀铅双染法。标本观察采用日本JEOL公司的 JEM200EX型电子显微镜。

　　1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。安静对照组与单纯运动组、单纯运动组与运动服药组之间采用单因素方差分析分析显著性差异，采用成组设计的t检验;组间比较采用独立样本t检验。检验水准为α=0.05，所有数据一律用x±s表示。

　　2 结 果

　　2.1 X线表现 整个运动期间，所有动物的胫骨X线变化不大，仅E4W组中有一例胫骨上端出现轻微骨膜反应。

　　2.2 实验兔胫骨核素骨显像表现 根据异常核素骨显像诊断方法[3]，发现E1W组和E2W组无异常核素骨显像出现;E3W组和E4W组出现多例异常核素骨显像，表现为胫骨核素分布不均，局部出现核素聚集“热点”，胫骨边缘粗糙，按分级标准多为Ⅰ级或Ⅱ级。EMT1W组和EMT2W组均只有一例Ⅰ级阳性表现。见表1。表1 不同运动及处理条件下胫骨核素骨显像变化

　　2.3 胫骨组织学变化

　　2.3.1 光镜观察结果 运动2周后，皮质内骨吸收腔(Howship陷凹)大而多，内以破骨细胞为主，哈佛氏管无扩张，并有血栓，出现少量纤维裂纹，裂纹小，且多位于骨单位的黏合线处。运动3周后，皮质内Howship陷凹多，且多局限分布于胫骨内侧缘，陷凹内成骨细胞有所增加，仍有破骨细胞，并有一些扩大的显微裂纹，其中一例骨内膜处出现镜下骨折线。运动4周后，皮质内Howship陷凹与运动3周时比较变化不大，内以成骨细胞为主，显微裂纹较运动3周时少，并有外膜处纤维增生。而服药1周后，皮质内Howship陷凹已明显减少，且陷凹内附以多层成骨细胞，骨外膜处纤维增生。服药2周后，皮质内Howship陷凹量少，腔小，衬以成骨细胞，并发现大量骨外膜下新生骨，部分新旧骨已完全融合。

　　2.3.2 图像分析结果 随着运动时间的延长，Howship陷凹面积逐渐增大(P<0.05，P<0.01)，但服药组的面积明显小于同周运动组。见表2。表2 胫骨皮质吸收腔面积在不同状态下的变化

　　2.4 胫骨电镜观察

　　2.4.1 骨细胞 运动1周后，骨细胞呈圆形或椭圆形，细胞核及胞浆变化不大，陷凹边缘显得较粗糙，可见少量分泌泡。运动2周后，骨陷凹扩大，骨小管及胞浆突起增粗、增多，可见少量线粒体，核膜上核孔增多，常染色质比例较大。运动3、4周后，骨陷凹明显扩大，边缘粗糙，线粒体、粗面内质网等胞浆细胞器增多，出现较多分泌泡，染色质以常染色质为主。而服药1周后，可见胞浆中有少量线粒体，核膜上核孔较多，有散在分泌泡，初步具有成骨相。服药2周后，发现陷凹内有大量絮状分泌物沉着，核膜上核孔增多，以常染色质为主，呈现较典型的成骨相。

　　2.4.2 成骨细胞 成骨细胞在不同运动时期，其超微结构均呈分泌型。但服药2周后成骨细胞胞浆内粗面内质网大量出现，高尔基体及线粒体量多，细胞核大，染色质基本为常染色质。

　　2.4.3 破骨细胞 在不同运动时期，破骨细胞电镜下的表现较为一致，细胞体积大，内有多个大小不等的细胞核，核内以常染色质为主，胞浆内有线粒体、粗面内质网、高尔基体，并有一些分泌泡，在细胞膜的边缘存在刷状缘(皱折缘)，正在进行骨的吸收。而服药各组破骨细胞少见，较难观察其形态变化。

　　2.5 PTH、BGP和睾酮的变化 跑跳运动1周后，血PTH水平显著升高(P<0.01)，运动2周后，PTH水平仍显著高于SC组(P<0.01);随着运动时间的延长，运动3周时PTH水平有所下降，但运动4周时又达最高值。而服药1周后，PTH水平显著升高，高于同周运动组(P<0.05);服药2周后，PTH水平又急剧下降，低于同周运动组(P<0.05)，并低于EMT1W组(P<0.05)。血BGP在跑跳运动2周后，较SC组显著升高(P<0.05)，继续的跑跳又使其水平显著下降(P<0.05);运动至4周时，服药组BGP水平较运动组明显升高(P<0.05)，且服药组之间差异也有统计学意义(P<0.05)。血睾酮水平随运动时间的延长，趋于降低，运动2周后达最低(P<0.01)，运动3、4周时亦处于低水平(P<0.05)，而服药1、2周后，血睾酮水平显著升高(P<0.05)。见表3。表3 血甲状旁腺素、骨钙素和睾酮水平在不同时期的变化

　　3 讨 论

　　“肾主骨”理论是中医整体观念的体现，是脏腑理论的一个重要方面。肾主藏精，精生髓，髓居骨中，骨赖髓之充养。若肾精不足，骨髓空虚，则肢体酸软无力，行动不便。《灵枢·本神》有“精伤则骨酸痿厥”。本研究采用持续性运动刺激，使实验动物产生疲劳，劳则气耗，久之精伤，导致肾虚，进而使骨骼产生损伤。脾主肌肉，为气血生化之源，脾健则肌肉充实，四肢活动有力，反之脾弱气血生化乏源，则肌肉瘦削，肢体疲软无力。强健的肌肉对骨有明显的保护作用，肌肉疲劳可引起肌肉应力吸收的能力明显降低，从而导致胫骨所受应力的增加和骨内应力分布的改变，最终造成骨组织的应力性损伤[4]。研究证实，健脾益气药物如黄芪、白术等可增加肌糖原含量，促进腺苷酸激酶的活性，提高骨骼肌有氧能力[5]，进而加强肌肉对骨组织的保护。气血是构成人体和促进人体生长发育的基本物质，气行血充，经脉为之所养，络脉畅通，则筋骨强劲。若筋骨损伤，气血也随之发生紊乱，最常见的是发生气滞血瘀证候，因此在骨骼损伤时，活血化瘀药物的应用是必然的。以往的研究[6，7]也发现，骨应力性损伤时，骨组织会出现瘀血现象，甚至产生血栓，活血药可明显改善微循环，促进骨组织的代谢功能，不仅改善局部的缺氧状态，而且可促进骨局部矿物质的沉积[8]。因此，根据以上理论及研究结果，本研究以补肾健脾活血为组方原则，客观评价中药对应力性骨损伤的防治作用。

　　首先，内服补肾健脾活血中药可以以新生骨的形式加快损伤骨组织的修复。本实验的组织学及电镜观察发现，服药1周后，即有少量的新生骨形成，服药2周后，实验动物胫骨骨细胞的超微结构表现出成骨活性，并有程度不同的新生骨，有的新生骨已与原有骨融合，明显地增加了胫骨横径的宽度。宽度的增加使单位面积所受的应力相应减少，无疑会对损伤的胫骨起到很好的保护作用，可防止胫骨产生骨折等进一步的损伤。对照单纯运动3周和4周组发现，服药后骨吸收腔进一步扩大，核素骨显像出现应力性骨折的阳性表现。可见中药对骨的应力性损伤具有一定的防治作用，而中药具体是通过什么细胞途径起作用，是抑制破骨细胞性骨吸收或促进成骨细胞的成骨活性，还是减少破骨细胞的募集分化而增加成骨细胞的募集分化，仍需进一步研究。

　　从血生化指标的变化可以看到，服药2周后，血PTH显著下降，BGP快速增加，血睾酮也明显增加。低PTH显示破骨细胞性吸收的减少，甚至停止，同时低PTH表示骨吸收与骨形成处于解偶联状态，此时血BGP成为骨形成的特异性标志[9]。因此高BGP和高睾酮反映了成骨细胞性骨形成的增加。骨形成的增加是由于成骨细胞活性的增强还是成骨细胞数目的增加呢?从组织学看出，服药2周后，骨表面特别是新生骨表面，成骨细胞数目增多，显示中药可促进成骨细胞数目的增加，但对成骨细胞活性的作用，因为我们没有进行更多的骨形态计量学研究，如没有测量类骨质表面积(反映成骨细胞数目)及厚度(反映成骨细胞活性)，因此对此还难以下结论。但目前从相关的研究中发现[1013]，无论是杜仲、黄芪、牛膝、补骨脂、淫羊藿等单味药物还是补肾健脾活血方、补肾活血液等复方均对体内外成骨细胞的活性有良好的促进作用。

　　本研究采用熟地、杜仲、牛膝等补肾药物，配合健脾益气药黄芪、白术等，能起到补精髓、强肌肉等作用，同时实验显示，中药可能通过增加成骨细胞数目提高成骨细胞性骨形成能力，加速填充吸收腔速度，使骨改建又达到新的平衡。这不仅阻止了生理性骨疲劳向病理性骨损伤转化，而且还以新生骨形式增强了胫骨的强度。

　　需要指出的是中药对胫骨应力性损伤作用的时间问题，服药1周后出现了一个似乎矛盾的事实，就是此时血PTH显著升高，高PTH意味着吸收的增加，但在组织学上并没有一致的表现。我们的解释是：服用1周的药物引起成骨反应的加快，形成类骨质，而类骨质只有矿化后才能生成具有一定刚度并能对抗机械应力的骨质组织。从类骨质到被矿化大约需要5～10 d[14]，矿化时需要钙、磷等大量矿化质，此时血PTH的升高，可以动员全身的矿物质，运往胫骨局部，以备新生类骨质的矿化之用，但这种动员是暂时的、生理性的。继续用药的第2周，矿化基本结束，PTH又降至正常水平。此外，服药1周后BGP无大的变化，服药2周后显著升高，表明用药时间必须有一定的保证，这样才能使新生骨顺利生成。

　　其次，补肾健脾活血中药可提高血睾酮水平，纠正“肾虚”状态。研究证实，肾阳虚时，下丘脑垂体性腺轴功能下降，引起血睾酮水平的降低，而长期运动刺激可导致低血睾酮，因此有人认为，运动引起的血睾酮下降与中医“肾阳虚”相似[15]。本实验也发现，持续性的运动刺激，产生运动性低血睾酮，这不仅使局部骨组织骨吸收加快，导致骨抗变形能力下降，而且引起整个机体处于“肾虚”状态。研究表明，补肾中药可提高下丘脑对激素的反馈作用，明显提高血睾酮水平，促进机体“肾虚”状态的恢复[15]。本实验亦表明，服用以补肾为主的中药能明显提高血睾酮水平，而睾酮的增加，对损伤的骨组织具有良好的影响[16]。对比图像分析及组织学结果，此时骨吸收腔明显减少，并有大量新生骨生成。这表明血睾酮增加可能增强成骨细胞的骨形成能力和(或)抑制破骨细胞的吸收。

　　本实验结果表明，以补肾药为主的补肾健脾活血中药具有明显刺激新生骨形成，提高血睾酮水平的作用，可防止胫骨应力性损伤的发生与发展，并能促进其修复，起到治疗作用。这种治疗作用具有一定的时间累积效应，服药2周的治疗效果明显优于服药1周的效果。

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