聚乙二醇修饰海葵神经毒素rhk2a的分离与纯化

作者：黄慧,潘育方,郭晓娟,舒雅俊,杨帆 作者单位：(广东药学院 药科学院,广东 广州 510006)
【摘要】 目的 对聚乙二醇化海葵神经毒素(mPEGrhk2a)修饰产物进行分离与纯化。方法 将聚乙二醇(PEG)化反应所得混合产物超滤除盐后，采用SP650S强阳离子交换层析柱和CM650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化，收集不同NaCl离子浓度下的梯度洗脱液，经超滤除盐、冷冻干燥、SDSPAGE电泳检测，确定分离纯化mPEGrhk2a的色谱条件。结果 在保证mPEGrhk2a稳定性的前提下，随着缓冲液pH值的降低，2种阳离子交换柱与mPEGrhk2a的结合量均增加;在同一pH值下，强阳离子交换柱的结合情况更好。用SP650S强阳离子交换层析柱进行分离纯化时，洗脱液中溶液电导率在5～7 ms/cm时,mPEGrhk2a能被洗脱下来，而且盐离子浓度梯度变化越缓，mPEGrhk2a修饰产物各洗脱峰的分离度越高;用CM650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化时，修饰产物mPEGrhk2a主要在穿透峰中出现。结论 使用SP650S强阳离子交换层析柱，用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液与含0.5 mol/L NaCl 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液(后者比例变化为0%→50%)进行梯度洗脱，修饰产物mPEGrhk2a与未修饰的rhk2a得到了很好的分离。

【关键词】 聚乙二醇化海葵神经毒素;阳离子交换层析;分离;纯化

Isolation and purification of pegylated sea anemone neurotoxin rhk2aHUANG Hui,PAN Yufang,GUO Xiaojuan,SHU Yajun,YANG Fan

　　(School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou,Guangdong 510006,China) Abstract:Objective To isolate and purify mPEGrhk2a.Methods The mixture obtained from pegylated reactions was separated by Toyopearl SP650 column for strong ion exchange and Toyopearl CM650 column for weak cation exchange after desalted by ultrafiltration and the effluent of gradient elution was collected at various concentrations of sodium chloride,ultrafiltrated and freezedried,detected by SDSPAGE electrophoresis to determine chromatographic condition of isolate and purify mPEGrhk2a. Results With the preconditions of keeping mPEGrhk2a stable and reduced pH of buffer solutions,the binding capacity of both cation exchange columns and mPEGrhk2a increased. However,the capacity of the strong cation exchange was more than the week one. MPEGrhk2a was eluted by Toyopearl SP650 column for strong cation exchange when the concentration of NaCl was in the range of 5%～7%. The more slowly the concentration gradient changed,the higher of the resolution of diverse eluting peaks amongst modified products was. When using the Toyopearl CM650 column for weak cation exchange,the mPEGrhk2a mainly presented in penetration peaks. Conclusion The gradient elution was finished under the condition of 0.02 mol/L acetate buffer solution with pH 4.0 and the same acetate buffer solution (with the proportion change from 0% to 50%) containing 0.5 mol/L NaCl by using Toyopearl SP650 column for strong cation exchage. The products including pegylated and unmodified rhk2a were successfully isolated,which has laid a foundation for our further research on the properties of purified mPEGrhk2a.

　　Key words:mPEGrhk2a; cation exchange column chromatography; isolation and purification

　 PEG修饰蛋白质技术由于能够在保证药用蛋白活性的同时降低其在体内的免疫原性和毒副作用，延长血浆半衰期，增强其化学稳定性，增大溶解性，提高药用蛋白在体内的生物利用度，增加患者的顺应性，已成功用于改善多种蛋白质药物的性质。2000年中山大学生命科学院利用基因工程技术获得一种重组海葵神经毒素rhk2a，其对心肌组织产生很强的正性肌力作用，在治疗充血性心力衰竭方面有极好的应用前景[1]。为解决海葵肽类毒素rhk2a临床应用时存在稳定性差、毒性较大等问题，本课题组将PEG修饰技术应用于rhk2a，通过对各种反应条件的优化，得到了最佳工艺条件下的甲基聚乙二醇(mPEG)修饰的海葵神经毒素产物mPEGrhk2a[2]。但在mPEG修饰rhk2a过程中，由于大部分mPEG与rhk2a的偶联反应都是随机性亲核反应，所以偶联修饰产物往往都是由多种不同的偶联蛋白异构体组成的混合物。本研究旨在对mPEGrhk2a修饰产物进行分离与纯化。

　　1 材料与仪器

　　SP650S强阳离子交换层析柱料、CM650S弱阳离子交换层析柱料(日本TOSOH公司生产); Amicon TM Stirred Cell超滤装置、再生纤维素超滤膜(截留分子量1000)(美国Millipore公司);Biologic LP层析系统(美国BioRad公司);BETA18K型冷冻干燥机(德国CHRIST公司);Delta320pH计(梅特勒托利多公司)。

　　2 实验方法

　　将rhk2a按照最佳工艺条件修饰后得到的mPEGrhk2a 修饰反应混合物， 用截流分子量为 1 000的超滤膜超滤除盐，然后用被缓冲溶液平衡后的阳离子层析柱进行分离纯化[3,4]，考察不同盐离子浓度缓冲液的分离效果，收集各洗脱峰的流出液，将收集液超滤除盐后， 转入50 mL离心管中， 于-80 ℃下预冻3～4 h，在-35～-20 ℃下抽真空冷冻干燥24 h，所得产物用TrisTricine系统进行SDSPAGE电泳检测。

　2.1 平衡、洗脱缓冲液pH值的选择

　　2.1.1 SP650S强阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择 取试管7支，各加 1 g SP650S强阳离子交换层析柱料后，分别用纯水洗涤，每次10 mL，洗5次。考虑到mPEGrhk2a的稳定性[5,6]，各加入pH值分别为4.0、4.6、5.0、5.4的醋酸钠醋酸缓冲液与pH值分别为6.0、6.5、7.0的磷酸钠磷酸缓冲液淋洗，每次10 mL，洗5次，待柱料平衡稳定，在每管中加入2 mg 的mPEGrhk2a，摇动试管5～15 min，静置待柱料下沉，取每管上清液于280 nm下测定其紫外吸收值。

　　2.1.2 CM650S弱阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择 取试管7支，各加 1 g CM650S弱阳离子交换层析柱料后，余下操作同“2.1.1”。

　　2.2 2种离子交换层析柱分离纯化修饰产物的条件

　　SP650S强阳离子交换层析柱的规格为2.6 cm×4 cm(柱容量1 CV=25 mL)，柱平衡液为3 CV的pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，色谱柱清洗液为5 CV 的0.5 mol/L NaOH溶液。CM650S弱阳离子交换层析法的色谱条件同上。

　　SP650S强阳离子交换层析法用于梯度洗脱的缓冲液见表1;CM650S弱阳离子交换层析法依次更换的洗脱液为NaCl含量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mol/L 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液各5 CV。

　　3 结 果

　　3.1 SP650S强阳离子交换层析和CM650S弱阳离子交换层析洗脱条件的选择与比较表1 SP650S强阳离子交换层析法所用的梯度洗脱液醋酸盐缓冲液的比例第一组100%→0%0%→100%(20 CV)第二组前半段100%→40%0%→60%(20 CV)后半段40%→0%60%→100%(10 CV)第三组100%→50%0%→50%(20 CV)

　　用一系列不同pH值的缓冲液平衡2种离子交换层析柱料，测得其相应上清液的紫外吸收值，结果如表2所示，随着缓冲溶液pH值的升高，上清液的紫外(UV)吸收值增加，即洗脱液中的蛋白质含量增加;缓冲液的pH值越低，离子交换柱料与mPEGrhk2a的结合量越大,在同一pH值下，SP650S强阳离子交换柱料的mPEGrhk2a结合情况优于 CM650S弱阳离子交换柱料。因此，选用pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液平衡、洗脱2种层析柱，此时色谱柱有效交换容量最大，mPEGrhk2a的分离效果相对较好。表2 不同pH值缓冲液下SP650S与CM650S柱料上清液的紫外吸收值

　　3.2 SP650S强阳离子交换层析法分离修饰产物

　　用pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲溶液平衡SP650S强阳离子交换柱后上样,mPEGrhk2a修饰反应所得混合产物依次采用盐离子浓度梯度逐渐变缓的3组缓冲液进行洗脱，分离结果分别如图1的A、B、C所示洗脱液中溶液电导率在5～7 ms/cm时，mPEGrhk2a能被洗脱下来，盐离子浓度梯度变化越缓，mPEGrhk2a修饰产物各洗脱峰的分离度越高，则可将色谱图3所对应的洗脱条件作为强阳离子交换层析法的最佳分离条件。

　　收集在最佳分离条件(第3组缓冲液洗脱)下的吸收峰①、②、③、④所对应的流出液，超滤除盐、冻干，将分离产物进行SDSPAGE电泳检测，结果如图2所示：mPEG修饰产物与未修饰的rhk2a得到很好的分离，由各电泳条带的分子量初步判断，单修饰产物mPEGrhk2a在峰③中出现。

　　3.3 CM650S弱阳离子交换层析法分离修饰产物

　　用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲溶液平衡CM650S弱阳离子交换柱后上样，mPEGrhk2a修饰反应所得混合产物，依次更换含NaCl盐离子浓度不同的缓冲液进行梯度洗脱,结果如图3所示,主要修饰产物被穿流洗出。收集图3中吸收峰①、②、③所对应的流出液，超滤除盐、冻干，将分离产物进行SDSPAGE电泳检测，结果如图4所示：mPEGrhk2a修饰产物主要在穿透峰中出现，未修饰的rhk2a在0.1

　　4 讨 论

　　由于mPEGrhk2a偶联蛋白异构体除了分子量和表面电荷的细小差别之外，其他的理化性质非常接近，因此偶联产物的分离纯化一直是蛋白质PEG化技术的难点之一。蛋白质与PEG偶联之后表面电荷会发生变化，利用这种电荷差异可以将偶联蛋白分离，故国内外多采用离子交换层析法分离PEG修饰混合物[7]。

　　rhk2a中N末端氨基与mPEG共价结合后，失去与氢质子的结合能力，蛋白质分子中的正电荷会减少，因此mPEGrhk2a的等电点比rhk2a低。另一方面，由于mPEG长链会阻碍rhk2a与离子交换剂之间的电荷相互作用，即产生立体屏蔽作用，导致mPEGrhk2a在离子交换层析中的流出行为与rhk2a有所不同。这两方面因素决定采用离子交换层析法能够分离纯化mPEGrhk2a修饰反应混合物[7]。

　　由于阴离子交换树脂结合的主要是蛋白质的羧基，受氨基修饰影响较小，因而选择阳离子交换树脂分离纯化mPEGrhk2a。本文实验结果也证明，用强阳离子交换层析法分离mPEGrhk2a修饰反应混合物时，修饰产物mPEGrhk2a在柱上的保留时间比未修饰的rhk2a要短。说明mPEG修饰确实降低了rhk2a的等电点，屏蔽了rhk2a与离子交换剂之间的静电作用，使得在相同pH值条件下，修饰产物在柱上的吸附能力较弱。

　　用弱阳离子交换层析法分离mPEGrhk2a时，mPEGrhk2a修饰产物主要在穿透峰中出现，是因为mPEG修饰显著地降低了mPEGrhk2a的等电点，导致弱阳离子交换层析柱对mPEGrhk2a的结合力太弱，无法获得理想的分离效果。

　　本研究证明，修饰产物mPEGrhk2a,在平衡液的pH值为4.0时，与SP650S强阳离子交换层析柱有良好的结合;在洗脱液中溶液电导率在5～7 ms/cm时，可被洗脱下来，并且与未修饰的rhk2a分离度良好，因此获得了纯度较高的mPEGrhk2a，为下一步的深入研究奠定了基础。

【参考文献】
　[1] 黄慧,潘育方,杨帆,等.海葵神经毒素药理作用研究进展[J].宜春学院学报,2008,30(2):127-129.

　　[2] 杨帆,潘育方,黄慧,等.重组海葵神经毒素rhk2a的修饰产物、其修饰方法及应用:中国,200910038615.2[P].2009-09-23.

　　[3] 王磊.重组海葵神经毒素在大肠杆菌中的高表达、纯化、活性、构效关系及作用机理的研究[D].中山大学博士学位论文,2004.

　　[4] 刘文华.海葵神经毒素的基因克隆、重组表达、纯化及生物学活性鉴定[D].中山大学博士学位论文,2001.

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　　[7] FEE C J,VAN ALSTINE J M.PEGproteins:Reaction engineering and separation issues[J].Chem Engin Sci,2006,61(3):924-939.