大肠癌患者T细胞亚群和NK细胞活性检测的意义

作者：姬清华， 李国胜， 张汝一， 颜登国 作者单位：(贵阳医学院附院 肛肠外科， 贵州 贵阳 550004)
【摘要】 目的： 通过检测大肠癌患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞活性的表达，研究大肠癌患者免疫状况与肿瘤分期的关系，以预测术后恢复情况。方法： 采用流式细胞分析法检测60例大肠癌患者和30例对照者外周血中T淋巴细胞亚群及NK细胞活性。结果： 大肠癌患者CD4+细胞值、CDM4+/CD8+比值下降且NK细胞活性显著降低，CD8+细胞值显著高于对照组，这种变化随临床分期的增高更加显著(P<0.05);化疗后CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值的下降和NK细胞活性的降低及CD8+细胞值的增高更为突出(P<0.01);术后发生转移的患者CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值下降及NK细胞活性下降，CD8+细胞值再回升。结论： 大肠癌患者细胞免疫功能明显紊乱，并随病情进展及肿瘤转移而加重，切除肿瘤有助于改善患者细胞免疫功能。

【关键词】 肠肿瘤; 淋巴细胞亚群; 杀伤细胞，天然; 流式细胞术

Determination of T Cell Subgroups and NK Cells in PeripheralBlood of Colon Cancer Patients and Its Clinical Significance

　　JI Qinghua, LI Guosheng, ZHANG Ruyi, YAN Dengguo

　　(Coloproctological Department, The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004， Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To detect lymphocyte T subsets and NK cells in peripheral blood of patients with colon cancer (CC), and to investigate the relationship between the immune function and Dukes stage of the disease. So as to provide information for prognosis of the patients after operation. Methods: Lymphocyte T subsets and NK cells in peripheral blood of 60 CC patients and 30 healthy people (control group) were detected with flow cytometry. Result: The amounts of T cell CD4+ and the rations of CD4+/CD8+, and NK cytotoxicity were significantly higher, and the amounts of T cell CD8+ were significantly lower in CC patients than those in control group; These changes became more obvious along with the decrease of Dukes stages of the disease (P<0.05). After the chemotherapy, the increase of T cells CD4+, CD4+/CD8+ ratio, and NK cytotoxicity and the increase of T cell CD8+ were getting more remarkable (P<0.01). The same occurred in cases with metastasis after operation. Conclusions: Cell immune function disorder occurs in CC patients, and becomes more severe along with the development of disease and metastasis. Excision of tumor might benefit the improvement of cell immune function of the patients.

　　[Key words] intestinal neoplasms; lymphocyte subsets; killer cells,natural; flow cytometry

　　大肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，在我国大肠癌的发病率有逐年增高的趋势。现代研究证实，肿瘤的发生发展与肿瘤宿主的免疫状态密切相关，而机体抗肿瘤免疫效应中以细胞免疫为主，T淋巴细胞亚群及NK细胞在肿瘤免疫监视中起中心调控作用，是机体抗肿瘤免疫的重要效应细胞。对60例大肠癌患者的外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞活性进行了测定，并与30例健康体检自愿者进行对照，以探讨其临床应用价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 检测对象

　　大肠癌组共60例, 均来自贵阳医学院附属医院肛肠科，术前未经化疗，术后经病理证实，其中男35例，女25例，年龄22～74岁，平均52岁。Dukes分期：B期14例，C期33例，D期13例。对根治术后完整随访的31例患者动态观察2年，其中8例发生转移。对照组来自健康体检自愿者，共30例，其中男16例，女14例，年龄19～58岁，平均39岁。

　　1.2 标本采集、处理及检测方法

　　用EDTA二钾抗凝真空采血管取外周静脉血2 ml，标本在4 h内作染色处理。60例大肠癌患者术前和30例健康体检者采血1次;28例患者根治术前及术后完整随访2周各采血1次;22例完整随访患者化疗前及化疗后2周分别采血1次;31例患者根治术后，23例无转移，8例有转移，各采血1次。

　　1.3 处理及检测方法

　　设阴性对照管和试验管，分别加入荧光抗体IgG1/IgG2a、CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+CD56、CD3/AntiHLADR(FITC/PE)、CD8/AntihlaDr(FITC/PE)20μl,在每管内加入抗凝全血100 μl，立即充分混均，室温避光孵育30 min，然后加入1倍稀释的溶血素(FACS溶解液)2 ml裂解红细胞，迅速混均置室温避光8～12 min后，以1 000 r/min离心5 min,弃上清液，加入2 ml PBS洗涤2次，弃上清液，加入1 ml PBS混匀将细胞悬浮后立即流式细胞仪检测。采用美国BD公司提供的流式细胞仪FACSCalibur，以三色荧光标准微球，启动FACSCom软件，利用Cellquest软件进行标本检测及分析。

　　1.4 统计学处理

　　所有变量均以x±s表示，以配对设计t检测及成组设计t检验进行数据分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 大肠癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞活性

　　与正常对照组相比较，大肠癌患者CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值及NK细胞活性均显著降低(P<0.01), CD8+细胞值则显著升高(P<0.01)，见表1。

　　2.2 大肠癌临床分期与T细胞亚群及NK细胞活性的关系

　　大肠癌患者T淋巴细胞功能和NK细胞活性与临床分期密切相关，随着肿瘤分期的进展和肿瘤负荷的增大，随着CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值的减小及NK细胞活性逐渐减弱(P<0.05), CD8+细胞值逐渐增大。见表1。

　　2.3 手术治疗、化疗对大肠癌患者T细胞亚群及NK细胞活性的影响

　　大肠癌患者根治术后2周，CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值显著增大，NK细胞活性明显增强，而CD8+细胞值下降，手术前后差异有显著性(P<0.05)。化疗后2周，患者外周血CD4+ 细胞值、CD4+/CD8+比值下降，NK细胞活性显著减弱，而CD8+细胞值增高(P<0.01)。表明化疗使患者T细胞及NK细胞功能受到明显抑制，见表1。

　　2.4 术后2年患者T细胞亚群及NK细胞活性

　　动态观察31例随访资料完整的患者，其中有8例大肠癌出现远处转移。有转移患者的CD4+ 细胞值、CD4+/CD8+比值下降，NK细胞活性降低，而CD8+细胞值又见回升，与未转移者相比差异显著(P<0.01)，见表1。表1 不同组别T细胞亚群及NK细胞活性

　　3 讨论

　　T细胞及NK细胞是肿瘤免疫的重要效应细胞，是宿主抵抗肿瘤细胞生长的第一道防线[1]。机体正常的免疫机制有赖于辅助性T细胞与抑制性T细胞比值的协调，故NK细胞及T淋巴细胞及其亚群能够直接反映机体细胞免疫的状态。本研究发现，大肠癌患者CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值及NK细胞活性明显低于正常人，而CD8+细胞值显著增高，表明细胞免疫功能严重受损，这与文献报道的相一致[2];且随Dukes分期的进展而更趋明显，反映直肠癌患者机体的细胞免疫功能低下，随着肿瘤的进展，机体抗肿瘤作用不断削弱，致使肿瘤在体内长成繁殖并迅速扩散。多数学者研究认为在肿瘤的发展过程中，肿瘤细胞分泌多种免疫抑制因子，诱导和激发产生抑制性T淋巴细胞，使CD4+/CD8+比值下降[3]。大肠癌根治术后2周患者外周血CD4+T辅助细胞表达增加，CD4+/CD8+比值增大，NK细胞活性显著增强，抑制性T淋巴细胞减少，这与文献报道的基本一致[4,5]。术后2年动态观察发现，无复发及转移患者的T淋巴细胞及NK细胞功能得到进一步改善，表明切除肿瘤有助于改善患者的细胞免疫状态。大肠癌患者的免疫抑制是肿瘤源性的，即与肿瘤分泌的可溶性免疫抑制因子有关。切除肿瘤可使抑制因子减少，机体的免疫监视功能得到恢复，宿主抗肿瘤免疫逐渐增强，通过MHCII 类抗原HLADR 诱导出强烈的T细胞免疫应答，导致CD4+T细胞的活化和产生各种细胞因子，从而使NK细胞的活性增强，同时诱导CD8+或CD4+ 细胞介导的ADCC效应增强[5～7]。因此，对大肠癌患者应尽可能施行根治手术，最大限度地减轻肿瘤负荷及减少免疫抑制因子，以利于患者免疫功能的重建及后续治疗[8～10]。术后转移患者CD4+细胞值、CD4+/CD8+比值再度减小，NK细胞活性再度下降，CD8+细胞值又见增大，与无瘤生存患者相比差异有显著性。因此，动态监测患者T细胞亚群及NK细胞活性对判断术后肿瘤复发或转移有一定的参考意义。大肠癌患者化疗期间细胞免疫功能抑制加重，不利于T淋巴细胞和NK细胞的免疫监视作用，并导致各种感染的发生。因此，对大肠癌患者化疗同时辅以免疫治疗以减轻化疗对全身的免疫抑制作用是非常必要的。综上所述，大肠癌患者的T细胞亚群及NK细胞活性水平的检测，虽然不能直接反映患者免疫细胞对肿瘤的攻击能力，但对分析肿瘤的发展情况、判断疗效有一定参考价值。

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