辛伐他汀防治心肌细胞肥大效应及其与钙通道关系的研究

作者：耿鹏 吴扬，杨惠超，刘 娟 作者单位：(南通大学航海医学研究所，南通226001)
【摘要】 目的：探讨辛伐他汀对心肌细胞肥大的防治作用及其与钙通道活动的关系。方法：采用血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大模型。应用改良Lowry法测定心肌细胞总蛋白含量。相差显微镜测定心肌细胞表面积。CCK-8法检测心肌细胞活力变化。western blot方法检测心肌细胞 L-型钙通道亚单位Cav1.2(α1C)、T-型钙通道亚单位Cav3.1(α1G)、Cav3.2(α1H)蛋白表达的变化。应用激光共聚焦显微镜技术检测[Ca2+]i的变化。结果：(1)辛伐他汀能明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞总蛋白含量及细胞表面积的增加，同时提高心肌细胞活力;(2)辛伐他汀能明显降低心肌细胞T-型钙通道α1G、α1H蛋白表达，但对L-型钙通道α1C蛋白表达无明显影响;(3)辛伐他汀可呈剂量依赖性抑制心肌细胞肥大所致的钙离子超载。结论：辛伐他汀对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大具有明显的防治作用，其作用机制可能与辛伐他汀抑制T-型钙通道α1G、α1H蛋白的重新再表达有关，并与其抑制细胞内钙超载密切相关。

【关键词】 心肌细胞肥大;T-型钙通道;L-型钙通道;辛伐他汀

The effects of simastatin on calcium channels in preventing cardiac hypertrophy

　　GEN Peng，WU Yang，YANG Huichao，et al (Institute of Nautical Medicine, Nantong University, Nantong 226001 )

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of simvastatin on calcium channels in preventing cardiac hypertrophy.Methods:Total protein content was measured by Lowary,s method and the cell surface area was measured by phase contrast microscope.CCK-8 method was used to observe the viability of myocardiocytes. The expression of α1C、α1G and α1H were detected by western blot. Intracellular Ca2+ were measured with Fluo-3/ AM under confocal laser microscope.Results: The total protein content and cell size of cardiomyocytes increased significantly and the cardiomyocyte viability decreased in AngⅡ treated cells and these effects could be blocked by simvastatin.The protein of α1G and α1H were significantly increased after AngⅡtreatment, which could be inhibited by simvastatin or verpamil hydrochloride. But the protein level of L-type calcium channel α1C was no significant difference between each group.Intracellular calcium overload was remarkably inhibited by simvastatin with a concentration-dependent manner.Conclusions:SIM can inhibit Ang Ⅱ-induced cardiomyocyte hypertrophy, which may be related to the inhibition of the increasing of T-type calcium channel subunit α1G、α1H, and meanwhile to the inhibition of calcium overloading.

　　[Key words] Cardiac hypertrophy; T-type calcium channel; L-type calcium channel; Simvastatin

　　心肌肥大是心血管疾病的一种常见的并发症，是引起猝死、心力衰竭的独立危险因素。心肌肥大不仅是细胞体积的增大，还涉及心肌细胞离子通道、离子流及膜电位的变化。近年来随着细胞电生理学和分子生物学技术在心血管疾病研究领域的广泛应用，关于钙通道在心肌肥大中的作用正逐渐被人们所关注。近年来有研究发现[1]他汀类药物可能具有防治心肌肥大的作用，但其作用机制的研究则少见报道。本研究采用血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导心肌细胞肥大模型，观察他汀类药物辛伐他汀(simvastatin,SIM)对心肌细胞肥大的防治作用，同时观察SIM对心肌细胞L-型钙通道α1C和T-型钙通道α1G、α1H各亚单位蛋白表达的影响，以及心肌细胞内Ca2+的变化，从而深入探讨SIM对心肌肥大的防治作用及其机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要药物和试剂 SIM (浙江瑞邦药业有限公司);AngⅡ(Sigma 公司);盐酸维拉帕米(Verapamil hydrochloride, Ver)(河北医科大学海森医药有限公司);甲羟戊酸(Mevalonolactone, MVA)(Sigma公司)。

　　1.2 动物与分组 新生1~3天SD大鼠，由南通大学实验动物中心提供。实验分组：(1)对照组(Control组);(2)AngⅡ组(10-6mol/L);(3)AngⅡ+Ver(10-7mol/L)组;(4)AngⅡ+SIM(10-6mol/L)组，(5)AngⅡ+SIM+MVA(10-4mol/L)组。

　　1.3 心肌细胞培养 新生SD大鼠，75%乙醇消毒，取心脏置预冷的D-Hanks液中，将心室肌切碎约1 mm3、加入10 ml 0.125%胰酶，搅拌消化10 min，弃上清，吹打分散细胞，孵育8 min。经滤网过滤后，接种于100 mm规格的无菌组织培养瓶中，于5%CO2、高湿度的37 ℃培养箱中放置2 h。孵育后，收集所有培养液，台盼蓝染色观察细胞存活率，细胞计数后将细胞密度调整至(5~6)×105 cells/L接种于6孔培养板，每孔2 ml。每孔加入Brdu使其终浓度为0.1 mmol/L。培养48 h后，换无血清培养基，24 h后加入干预因素。

　　1.4 心肌细胞蛋白质含量的测定(改良Lowry法) 6孔培养板培养的心肌细胞，加入1 mg/ml牛血清白蛋白，用双蒸水定容至2.98 ml。按操作步骤处理后，用紫外分光光度计660 nm比色，对照标准曲线，测定细胞总蛋白质含量。

　　1.5 心肌细胞大小的测定 心肌细胞加药持续5天后，用胰酶消化使之脱落，在相差显微镜下拍照。每孔取10个视野，每个视野取10个细胞，采用HJ2000通用图像分析系统，通过标尺测量细胞表面积，取平均值。

　　1.6 CCK-8法检测心肌细胞活性 96孔培养板培养的心肌细胞，每孔加入10 μl CCK-8(5 g/L)溶液，37 ℃孵育1~2 h，采用全自动酶标仪于450 nm波长测OD值(A)，OD值的大小反映活细胞的数量。

　　1.7 Western Blot检测 取心肌细胞的蛋白提取液进行10%SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色、脱色至背景清晰。电泳结束后，进行电转移，转移后的PVDF膜切取标准蛋白泳道进行膜染色。其余用洗膜缓冲液洗5 min，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭，洗膜，浸入一抗(1∶200)，4 ℃过夜。液膜浸入二抗(1∶1 000)，定温孵育2 h。洗膜，ECL试剂显色。用四星图像分析系统测定Western Blot蛋白条带的灰度值，计算目的条带和内参条带的比值。分别以α1C、α1G、α1H带与β-actin带灰度比表示α1C、α1G、α1H蛋白相对含量。

　　1.8 钙成像试验 将培养的心肌细胞吸去培养液，用终浓度5 μmol/L的Fluo-3/AM溶液染色，进行Fluo-3/AM负载，采用激光共聚焦显微镜进行钙离子浓度基线扫描。通过共聚焦显微扫描分析胞内游离Ca2+浓度动态的变化。

　　1.9 统计学方法 采用Origin7.5软件进行统计学分析，各组计量资料以x±s表示，组间比较采用进行方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度SIM对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的影响 见表1。AngⅡ+SIM(10-8～10-7 mol/L)组心肌细胞总蛋白含量较AngⅡ组均无明显变化(P>0.05)。表明10-6～10-4 mol/L终浓度的SIM均能有效抑制AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成增加，其中10-6 mol/L SIM为抑制AngⅡ诱导心肌细胞蛋白合成增加的最适有效浓度。

　　2.2 SIM、Ver对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响

　　见表2。AngⅡ+SIM+MVA组蛋白含量及细胞表面积与AngⅡ组比较则无明显变化(P>0.05)。表明SIM能有效抑制心肌细胞蛋白合成的增加及细胞表面积的增加，且与Ver作用相似，两者差异无统计学意义。MVA则拮抗了SIM对心肌细胞蛋白合成以及细胞表面积的增加的抑制作用。

　　2.3 SIM对心肌细胞活力的影响 AngⅡ组A450nm值与对照组比较明显下降(P<0.01);同时分别给予10-8～10-4 mol/L SIM或者Ver干预，结果表明给予10-6～10-4 mol/L SIM或Ver处理后，A450nm值显著高于AngⅡ组(P<0.01)，但给予10-8～10-7mol/L SIM后，A450nm值与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P>0.05);AngⅡ+SIM+MVA组与AngⅡ组比较亦差异无统计学意义(P>0.05)。提示AngⅡ可诱导细胞活力显著下降，应用10-6～10-4 mol/L SIM和Ver均可显著提高心肌细胞活力，其中10-6 mol/L SIM的作用效果最佳(P<0.01)，而MVA则抑制了SIM对心肌细胞活力增强的作用(图1)。

　　2.4 SIM对AngⅡ诱导心肌细胞钙通道蛋白表达的影响 各实验组L-型钙通道亚单位α1C蛋白表达量与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。AngⅡ组与对照组相比，α1G、α1H蛋白表达均明显增加(P<0.01);AngⅡ+SIM组、AngⅡ+Ver组α1G、α1H蛋白表达较AngⅡ组均显著下降(P<0.01);AngⅡ+SIM组和AngⅡ+Ver组相比差异无统计学意义(P>0.05);而AngⅡ+SIM+MVA组与AngⅡ组比较，α1G、α1H蛋白表达无明显差异(P>0.05)(图2，3)。结果表明，AngⅡ诱导的肥大心肌细胞T-型钙通道亚单位α1G、α1H蛋白表达均明显增加。SIM或Ver对心肌细胞肥大引起的T-型钙通道α1G、α1H蛋白表达增加均具有明显的抑制作用，且二者作用效果相似，而MVA则拮抗了SIM对α1G、α1H蛋白表达的抑制作用。SIM或Ver对L-型钙通道亚单位α1C蛋白表达则无明显影响。

　　2.5 SIM对AngⅡ诱导心肌细胞钙离子超载的影响 AngⅡ组心肌细胞内钙离子浓度明显升高;当同时加入SIM时，则明显抑制了AngⅡ引起的细胞内钙离子浓度的升高, 且这种抑制作用具有浓度依赖关系，其中SIM 10-6 mol/L时作用最显著(P<0.01);而AngⅡ+SIM+MVA组心肌细胞内钙离子浓度与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P>0.05);Ver阳性对照组与AngⅡ组比较钙离子浓度明显降低(P<0.01)(图4，见封二)。结果表明，10-6～10-4 mol/L SIM均能明显抑制AngⅡ引起的心肌细胞钙超载，其作用与Ver相似，提示SIM可能与Ver一样，均通过阻断钙通道降低心肌细胞钙超载而发挥作用，而MVA则拮抗了SIM对心肌细胞钙超载的抑制作用。

　　3 讨 论

　　业已证明，AngⅡ具有生长因子样作用，是刺激心肌肥大的主要生物活性物质之一。本实验结果显示，在原代培养的新生大鼠心肌细胞中加入AngⅡ作用一定时间后，心肌细胞蛋白合成及心肌细胞表面积均明显增加，这一结果与本课题组以往的研究及其它文献报道的结果是一致的[2]，表明本研究采用AngⅡ诱导心肌细胞肥大的实验模型已成功建立。

　　本研究观察了他汀类药物SIM对心肌肥大的防治作用，同时选用钙通道阻滞剂Ver作为阳性对照药。MVA是胆固醇生物合成中HMG-CoA经还原酶作用的产物,有研究表明MVA可通过甲羟戊酸途径拮抗SIM的作用，因此本研究应用MVA作为SIM的拮抗剂，进一步证实SIM对心肌肥大的防治作用。

　　本研究结果显示， 10-6～10-5 mol/L终浓度的SIM能有效抑制AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成增加，但当SIM增加至10-4 mol/L以上浓度时，心肌细胞总蛋白含量反而低于对照组，这可能由于过高浓度的SIM对心肌细胞产生毒性作用所致。实验还发现，10-6 mol/L浓度的SIM能明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成和细胞表面积的增加，其效果与钙通道阻滞剂Ver作用相似。表明SIM对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大具有明显有效的防治作用。

　　本研究发现，AngⅡ诱导心肌细胞肥大后，心肌细胞活力明显下降。应用SIM预处理，可以显著提高心肌细胞活力，该作用与阳性对照药钙通道阻滞剂Ver作用效果相似。而同时应用SIM拮抗剂MVA处理后，心肌细胞活力则不再增加，提示MVA可能抑制了SIM提高心肌细胞活力的作用。

　　电压依赖性钙通道(voltage dependent calcium channel, VDCC)是位于细胞膜的跨膜异源多聚体蛋白质，其中央形成亲水性孔道，孔道的开放或关闭调节着细胞内钙离子的浓度，继而影响细胞功能。心肌细胞膜上只有两种VDCCs，即L-型和T-型钙通道[3]。L型钙通道α1亚单位有四种亚型，但心肌LVDCC仅高表达Cav1.2(α1C)。T-型钙通道α1亚单位有三种亚型组成，但在心脏中仅高表达Cav3.1(α1G)和Cav3.2(α1H)[4]。L-型钙通道由于在心肌兴奋-收缩耦联中的重要作用而被广泛研究。而T-型钙通道国内外研究相对较少。近年来随着膜片钳技术、分子克隆技术的应用和发展，使T-型钙通道的研究得以进一步深入。本研究观察了AngⅡ诱导培养的心肌细胞肥大中L-型钙通道α1C及T-型钙通道α1G、α1H表达的变化，以及SIM对心肌钙通道α1C、α1G、α1H各亚单位表达的影响。结果发现，各实验组心肌细胞L-型钙通道α1C蛋白表达水平均无显著性差异 (P>0.05)。对照组心肌细胞中可见α1G、α1H蛋白的表达;AngⅡ组α1G、α1H蛋白表达较对照组均显著增加(P<0.01);给予SIM或Ver干预后二者的蛋白表达水平出现不同程度的下降，且二干预组之间比较无明显差异;但同时给予SIM和MVA处理后则未能抑制T-型钙通道α1G、α1H蛋白表达的增加。业已证明，在正常成年大鼠心室肌细胞中仅有L-型钙通道表达,而T-型钙通道存在于胎鼠心肌细胞中，出生后T-型钙通道的密度逐渐下降，发育至正常成年大鼠后，心室肌细胞中则不再有T-型钙通道表达[5]。近年来有研究表明[6-7]，多种原因引起的心肌肥大均发现有T-型钙通道的异常表达和T-型钙电流的出现，这与本实验结果相似，提示T-型钙通道α1G、α1H亚单位蛋白的重新再表达可能是心肌细胞肥大的信号反应，T-型钙通道可能在心肌肥大发生发展过程中起着重要作用。

　　Ca2+作为细胞内第二信使，在细胞生理和病理过程中起着重要作用。本研究利用钙离子荧光探针从单细胞水平证实，心肌细胞肥大可显著增加细胞内游离钙离子浓度，造成细胞钙超载，本研究结果与其他实验室报道是一致的[8]。细胞内钙超载，一方面启动细胞坏死及凋亡程序，发生不可逆坏死;另一方面诱发后除极，导致恶性心律失常发生，造成心肌细胞的损伤。本研究在培养的心肌细胞实验中观察到，Ver预处理可抑制AngⅡ引起的[Ca2+ ]i内流增加。应用不同浓度的SIM处理后发现，SIM呈浓度依赖性抑制AngⅡ引起的[Ca2+ ]i内流增加。以上实验结果表明SIM与Ver作用效果相似，对心肌细胞肥大引起的细胞内钙超载均具有明显的抑制作用。

　　综上所述， SIM对心肌细胞肥大具有明显的防治作用，其作用机制可能与SIM通过抑制心肌细胞肥大所致的T-型钙通道亚单位α1G、α1H蛋白重新再表达有关，同时与其抑制细胞内钙超载密切相关。但与L-型钙通道亚单位α1C蛋白表达无关。

【参考文献】
　[1] Wu L，　Zhao L， Zhen Q，et al. Simvastatin attenuates hypertrophic responses induced by cardiotrophin-1 via JAK-STAT pathway in cultured cardiomyocytes[J].Mol Cell Biochem，2006，284(1-2):65-71.

　　[2] Liu J，Shen Q，Wu Y Simvatatin prevents cardiac hypertrophy in vitro and in vivo via JAK/STAT pathway[J].Life Sci，2008,82(19-20):991-996.

　　[3] Ono K, Lijima T. Pathophysiological significance of T-type Ca2+ channels: Properties and functional roles of T-type Ca2+ channels in cardiac pacemaking[J]. J Pharmacol Sci，2005,99(3):197-204.

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　　[8] Lu YM, Shioda N, Han F, et al. Imbalance between CaM kinase II and calcineurin activities impairs caffeine-induced calcium release in hypertrophic cardiomyocytes[J].Biochem Pharmacol，2007,74(12):1727-1737.