基因多态性与复合性眼病
作者：管怀进 作者单位：(江苏省医学重点学科， 南通大学眼科研究所, 南通大学附属医院眼科， 南通226001)【关键词】 复合性眼病;基因;单核苷酸多态性; 拷贝数变异
人类很多疾病的病因迄今仍不甚清楚，其中有些疾病病因复杂,可能有多种环境因素和(或)遗传因素参与,我们称之为复合性疾病(complex disease)。随着分子生物学和人类基因组的研究进展，已发现越来越多的病因不明的复合性疾病的发生主要与遗传因素有关。在复合性眼病方面，除了一些肯定的致病基因外，还发现更多的基因与眼病的发生发展有关。这些与眼病发生发展有关的基因被称为眼病相关基因，包括易感基因和保护基因等。
与眼病发生发展有关的基因其实属于遗传变异，也就是基因组DNA序列发生了变化，在DNA水平上表现为基因多态性(gene Polymorphisms)。如此DNA序列的不同可影响人类的很多特性，特别是对疾病的易感性。近年来，在DNA水平上发现了大量的遗传变异，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)、串联重复序列(tandem repeats)变异、转位因子(transposable elements)的存在或缺失以及结构变异(structural alterations)[1-2]等。
1 基因多态性的主要类型和研究方法
目前研究的基因多态性主要是SNPs和最重要的结构变异—拷贝数变异(copy number variations，CNVs)。
1.1 单核苷酸多态性(SNPs) SNPs是指不同个体间基因组水平上单个核苷酸的变异，它包括单个碱基的转换、颠换、插入或缺失，1996年SNPs被正式定为第3代遗传标记。其检测技术包括区分SNP特异位点的原理方法和数据的检测分析两部分。主要方法有：(1)聚合酶链反应(PCR)联合限制性核酸内切酶酶切技术：该经典方法在DNA分子内部若存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可判断是否有SNP位点以及出现的碱基替换类型;(2)Taqman荧光定量PCR法：Taqman探针与靶序列完全配对时才能结合，如有一个碱基错误便不能结合,从而识别是否有SNP位点以及出现的碱基替换类型。
由于任何种群中都是二等位基因性的，根据SNPs分析可估算等位基因频率。SNPs分析技术快速可靠、操作简单、易自动化、经济实用。从基因水平研究可提高其精确度和深度，大样本的群体分子流行病学研究，有望找到新的易感基因或保护基因。可见SNP分析技术特别适用于从群体水平和分子水平阐明常见复合性眼病的病因、发病机制及流行规律，为进一步的眼病防治措施提供依据，包括个性化的干预和治疗。
1.2 拷贝数变异(CNVs) CNVs是人类基因组内从1 kb到几个Mb的DNA片段拷贝数的不同，包括DNA片段的删除、插入、复制和复合多位点的变异[3]等类型。以往一直认为DNA的SNPs是遗传变异最常见的形式，而当前的研究表明CNVs不仅广泛存在于正常个体[4]，且在整个基因组中覆盖的核苷酸总数至少是SNPs的3倍，可见CNVs可能在遗传变异和物种进化方面比SNPs起着更为重要的作用[4]，是今后研究包括眼病在内的人类疾病的热点[1]。
目前检测CNVs的方法有基于克隆的比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)技术、微阵列-比较基因组杂交(microarray-CGH)、ROMA、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)、SNP芯片等，其中以比较基因组杂交最常用[1]。(1)比较基因组杂交技术：该技术是将消减杂交和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)相结合的技术，用于检测基因组间相对DNA拷贝数变化，并将这些异常定位于染色体上，因此又称为DNA拷贝数核型(DNA copy number karyotype)技术。该技术用不同的荧光染料分别标记靶基因组DNA和正常基因组DNA，再以相同比例与正常人中期染色体杂交，然后测定沿染色体长轴的两种荧光信号的相对强度比值，通过DNA间荧光信号比值的差别找出异常DNA区域。比较基因组杂交技术的优点在于通过同一次实验即可扫描整个基因组DNA序列的增加或丢失，实验所需的DNA样本量较少，且对DNA的来源和量没有特别的要求。局限性在于它所能检测到的最小的DNA扩增或丢失是在5~10 Mb，故对于低水平的DNA扩增和小片段的丢失会漏检;(2)FQ-PCR技术：通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。此技术用于拷贝数变异的检测时每次检测只限在一个座位，近年来基于PCR检测拷贝数变异的方法发展迅速。2008年Williams等提出的定量种间竞争性PCR法，可对基因组的多个座位进行拷贝数变异检测。FQ-PCR比较可靠，具有高通量、高安全性等优点。我们于2009年成功地将此方法用于检测白内障相关基因的拷贝数变异。
2 基因多态性与复合性眼病
2.1 SNPs与复合性眼病
2.1.1 年龄相关性黄斑变性相关基因SNPs 年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是50岁以上患者视力不可逆性损害的主要原因之一。其确切病因尚不十分清楚，可能与年龄、光损伤、环境因素、心血管疾病、吸烟、基因变异等因素有关。目前国内外研究发现包括以下基因在内的多种基因的SNP与AMD相关。
(1)补体因子H(CFH)：CFH基因位于染色体1q32上，这个区域在全基因组扫描中被证实与AMD相关[5]。目前已有多项研究支持CFH基因多态性与AMD相关。有人对AMD96例患者和50例对照者的基因组进行研究，发现一种常见的补体因子H变异与AMD明显相关，且变异的纯合子会使AMD发病危险度增加7.4倍。Albert 等发现在补体因子H基因的第402号氨基酸的变异与酪氨酸和组氨酸的改变有关，这一位点的变异可使AMD的发病危险度增加2.7倍。在我们的近期研究中发现CFHrs380390、rs1410996、rs800292和CX3CR1249、280以及HTRA1 rs11200638的多态性可引起汉族人AMD的发生，而在白种人中被反复证实的AMD相关位点CFHY402H与本研究中AMD无关，提示不同种族AMD易感基因不同。
(2)HTRA1：Wsger等在对澳大利亚的AMD242例患者和157例对照者的研究中发现，HTRA1基因的突变与渗出性AMD显著相关，带有危险性等位基因的个体患AMD的危险性增加2.7倍。另外日本AMD88例患者和97例对照者研究的结果表明，rs11200638与日本人群AMD发病明显相关，该位点的突变可以使AMD患病危险度增加10.1倍。
(3)CX3CR1：庹旌生等对AMD85例患者和105例对照者研究发现CX3CR1249的多态性使CD AMD患病危险度增加1.86倍，而CX3CR1280的变异使CD AMD的患病危险度增加1.94倍，使PD AMD患病危险度增加3.57倍。
(4)其他基因：载脂蛋白E(APOE)基因E2对年龄相关性黄斑变性发生有促进作用，而E4对年龄相关性黄斑变性发生有保护作用。有人检查了1166例患者和945例对照者，发现LOC387715 Ala69Ser和CFH Tyr402His都和年龄相关性黄斑变性相关，因此认为CLOC387715是除了CFH以外的第2个与年龄相关性黄斑变性相关的可疑基因。此外可能与年龄相关性黄斑变性相关的基因还包括fibulin 5、TLR4-D299G、ABCA4、PEDF等[6]。
2.1.2 糖尿病视网膜病变相关基因SNPs 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者严重的微血管并发症。DR形成的危险因素包括糖尿病的病程、发病年龄、血糖水平、血糖控制情况、高血压、肥胖、血脂异常等。近来的研究表明基因多态性对DR的发生发展也起着重要作用。目前已经筛选出的可能与DR密切相关的基因多达数十种，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因、糖基化终末产物受体(RAGE)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因、醛糖还原酶(AR)基因、过氧化物酶体增生物激活受体G(PPARG)基因、二氧化锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因、白介素-6(IL-6)基因、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因 、细胞黏附分子-1(ICAM-1)等基因。其中前4种基因有关位点SNP在不同国家不同种族人群中得到了相似的结论，重复性较好且目前比较肯定。
(1)VEGF基因：动物实验和临床研究都已证明VEGF在视网膜新生血管形成上具有重要作用。VEGF基因C-634G与DR间的关系最早于2002年由日本学者报道[7]，他们对2型糖尿病患者研究发现，C等位基因在DR患者中的表达明显高于非DR患者，而后印度人群和白种人群的研究也得到了相似结果[8]。我们的初步研究还提示VEGF基因内可能还存在DR的保护性基因。
(2)RAGE基因：糖基化终末产物(AGE)是一组不同种类的非酶糖基化蛋白、脂质和核酸，在高血糖和氧化应激情况下，AGE形成增加。AGE和RAGE结合后，导致受体后信号通路激活，细胞内氧自由基生成，基因表达激活，视网膜VEGF表达增加。Ramprasad等对印度人群研究发现RAGE基因启动子区的(-374T/A)多态性与非增殖型糖尿病视网膜病变(NPDR)的发生有关[9]，Lindholm对白种人群的研究也得到了相似的结果。
(3)MTHFR基因：大量研究表明高同型半胱氨酸(Hcy)血症是促进糖尿病微血管并发症的重要危险因素之一。Maeda等发现日本患者中MTHFR基因C677T可能是DR的易感基因。国内Huang等的研究和国外的另一些报道也得出了相同的结论。
(4)AR基因：过量的葡萄糖可激活多元醇通路的关键酶AR,使大量葡萄糖转变为山梨醇,并在细胞内蓄积，造成组织内渗透压增高、细胞肿胀,从而导致选择性毛细血管周细胞丧失,血管收缩能力和自身调节失常,血循环障碍,在DR的发生和进展中起重要作用。Olmos等及Dos Santos等分别对美国及巴西2型糖尿病患者的研究发现, AR基因(-106CC)基因型易患DR [10]。
(5)其他基因：Malecki等对波兰2型糖尿病(T2DM)患者PPARG基因研究发现，Prol2Ala与DR有关，能显著降低DR发生的危险性，但这种作用并不直接，至少部分与肾病相关。Lee等在2006年首先报道了MnSOD基因Ala16Val位点与T2DM患者眼部病变的关系。研究发现在黄斑水肿的患者中，A等位基因的频率显著降低，但未发现该位点多态性与DR间的关系。Petrovic等对斯洛文尼亚T2DM患者研究进一步发现MnSOD基因VV基因型在DR者中显著增高，考虑其为DR的易感基因。Pudofsky等发现IL-6 CC基因型携带者DR的发生率较其他两种基因型高，但对病程这一影响因素进行回归分析后，该显著性差异消失。当将1、2型糖尿病患者分别进行分析后，发现该基因型与两种糖尿病患者的DR发生有关联趋势，但仍未达到统计学差异。波兰对1型糖尿病青少年患者的一项IL-6研究发现，GG携带者DR和糖尿病肾病的发生率极低，表明GG基因型可能为DR的保护基因。该研究还发现GG携带者中尿IL-6的浓度较高，两者间是否有因果关系目前尚不清楚。Beranek等发现，bFGF C754G位点可能与DR有关，C等位基因和CG基因型频率在DPR患者中明显增高。Petrovic等发现另一位点T-553A与DR相关，AT基因型频率在DR患者显著升高。Kamiuchi等对日本人群研究发现ICAM-1 K469E位点上，DR患者中，KK基因型频率是非DR的T2DM者的3倍，揭示了其与DR相关。国内Liu等的研究也得出了相似的结论。
2.1.3 其他复合性眼病相关基因SNPs 视神经病变诱导(OPTN)基因、小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(TIGR)基因的SNP明显增加了原发性开角型青光眼的风险。遗传性全白甲(LOC)基因的SNP与汉族人高度近视的发生发展有关。谷胱甘肽-S转移酶(GSTM1)基因在土耳其人群中与老年性白内障的发展有关，在意大利人群中则无类似关系。
2.2 CNVs与复合性眼病 目前已发现一些眼病的发生与CNVs有关，其中白内障、青光眼、虹膜发育不良、葡萄膜黑色素瘤、X-连锁眼白化病1型等眼病与CNV的研究较为深入[1]。
2.2.1 白内障 2007年van Esch等[11]使用Array-CGH技术通过对患有严重脑病、双侧白内障和Fallot四联症的男婴研究，首次发现内含CDKL5基因和NHS基因的Xp22中间缺失。2008年Chen等通过对患有先天性白内障、小睑裂、严重的生长迟缓和智力低下的1例14岁男孩的遗传学研究，发现1p36的复制和缺失与这些疾病有关。2009年Quélin等发现13q的缺失引起与之相邻的SPRY2、GPC5等基因的缺失，导致新生儿先天性白内障和上肢异常等病症。Tyshchenko等首次发现3q29区域1.6 Mb的缺失与小眼畸形、白内障有关。我们的研究发现GSTT1完全缺失是年龄相关性白内障(ARC)，尤其是皮质性和后囊下性ARC发病的危险因素，而GSTM1可能不是ARC发病的危险因素。亚洲人群GSTT1完全缺失的频率一致，GSTM1完全缺失的频率不同，汉族人与高加索人GSTM1、GSTT1完全缺失的频率均不同。
2.2.2 青光眼 青光眼的发病和遗传方式非常复杂，可能涉及到多种基因的相互作用，属于多因素疾病。2000年Lehmann等[12]应用FISH技术通过对1个追溯6代的常染色体显性遗传的青光眼家系调查，首次检测到FOXC1基因的突变，发现含有FOXC1基因的6p25染色体的复制可引起青光眼、虹膜发育不良相关等发育异常。2002年通过对常染色体显性遗传的虹膜发育不良和早发青光眼两个家系的研究，首次发现6p25重排导致的6p25间隙复制和缺失与眼部发育障碍共分离有关。2007年Strungaru等研究表明，定位于4q25的PITX2基因的缺失联合FOXC1基因的复制，导致青光眼的预后明显比单独FOXC1基因变异的更差。
2.2.3 葡萄膜肿瘤 Gordon等研究证实葡萄膜黑色素瘤3号染色体部分或全部丢失;8号染色体或8号染色体的长臂拷贝数的增加(包含c-myc癌基因位点)可能是黑色素瘤发生发展的指征。另有少数研究表明6号染色体及1号染色体的变异也与黑色素瘤的发生有关。Aalto等通过对转移性和原发性葡萄膜黑色素瘤的研究发现转移性黑色素瘤比原发性拷贝数的改变更多，3号染色体、6q和1p的缺失，8q拷贝数的增加则提示预后不良。Willem等发现3号染色单体与伴有炎症的葡萄膜黑色素瘤有关，且是判断转移性肿瘤存活率和预后的最好指标之一。Sandinha等用染色体原位杂交的方法，通过对混合细胞型脉络膜恶性黑色素瘤64例患者的研究发现，3号染色体拷贝数的异质性与混合细胞型脉络膜黑色素瘤的细胞类型相关。
3 问题与展望
严重威胁人类视功能的许多致盲眼病的病因及发病机制目前仍很不清楚。不少研究已经提示基因多态性与AMD、DR、白内障、青光眼等复合性眼病的发生发展有关，但也发现一些问题和矛盾现象，使得结论不那么肯定。研究结果的不一致，甚至对同一个SNP的研究也出现相反的结论。其原因比较复杂，可能因所研究的国家和种族存在差异、不同地域的人种对疾病的易感程度不同、易感基因不一，加上复合性眼病的发生机制复杂，影响因素众多，特别是环境因素影响也显著。尽管存在着不同的研究结果和观点，对那些目前尚缺乏与复合性眼病相关证据的基因，仍不能完全排除其相关的可能性。我们应该不仅要选择以医院为基础的眼病患者作为研究对象，也要选择以社区人群为观察对象，尽可能扩大样本量、扩大国家、地区和种族、扩大基因位点，力争全基因检测，以逐步澄清基因多态性与多因素眼病的关系。识别复合性眼病的相关基因，在分子水平上了解其病因及发病机制，为这些疾病的早期诊断、预防治疗特别是个性化治疗奠定基础。
【参考文献】
[1] 周婧，管怀进.拷贝数变异及其在眼病分子遗传学研究中的应用[J].国际眼科纵览,2009，33(4):217-221.
[2] Freeman JL, Perry GH, Feuk L, et al. Copy number variation: New insights in genome diversity[J]. Genome Res， 2006, 16(8): 949-961.
[3] Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, et al. Global variation in copy number in the human genome[J].Nature, 2006, 444(7118): 444-454.
[4] Sebat J, Lakshmi B, Troge J, et al. Large-Scale Copy number polymorphism in the human genome[J]. Science, 2004, 305(5683): 525-528.
[5] Abecasis GR, Yashar BM, Zhao Y, et al. Age-related macular degeneration: a high-resolution genome scan for susceptibility loci in a population enriched for late-stage disease[J]. Am J Hum Genet， 2004, 74(3): 482-494.
[6] Guan H， Yang X.Featured distribution of AMD-susceptibility SNPs between ethnicities and the modifying effect of SNPs on AMD therapy[J].Expert Rev Ophthalmol,2009，4(4)：377-386.
[7] Awata T, Inoue K, Kurihara S, et al. A common polymorphism in the 51-untranslated region of the VEGF gene is associated with diabetic retinopathy in type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2002,51(5):1635-1639.
[8] Szaflik JP, Wysocki T, Kowalski M, et al. An association between vascular endothelial growth factor gene promoter polymorphisms and diabetic retinopathy[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2008,246(1):39-43.