人磷酯酰蛋白聚糖3 N端融合蛋白多克隆抗体制备及鉴定

作者：江枫 肖明兵 赵敏星1 , 倪润洲 ,周嘉伟2 作者单位：(1南通大学附属医院消化病研究室，南通 226001; 2中国科学院上海神经科学研究所)
【摘要】 目的：制备人磷酯酰蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3) N端蛋白的多克隆抗体。方法：在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达磷酯酰蛋白聚糖3 N端融合蛋白，从SDS-PAGE中切胶纯化，免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清，并用ELISA、Westen-blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功制备了抗磷酯酰蛋白聚糖3 N端的多克隆抗体，抗体滴度为1∶64 000，经Western blot检测特异性良好。结论：成功制备了抗人磷酯酰蛋白聚糖3 N端融合蛋白多克隆抗体。

【关键词】 磷酯酰蛋白聚糖3;融合蛋白;多克隆抗体;原发性肝细胞癌

Preparation and characterization of polyclonal antibody against human glypican3 N-terminal protein

　　JIANG Feng, XIAO Mingbing, ZHAO Minxing, et al (Department of Gastroenterology, Affiliated hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract]　Objective: To prepare rabbit anti-human Glypican3 N-terminal protein polyclonal antibody.Methods: The Glypican3 N-terminal protein was expressed in E.coli Rosetta. The rabbits were immunized by purified protein to produce polyclonal antibody. The anti-sera were identified with ELISA and Western blot analysis. Results:The polyclonal antibody against Glypican3 N-terminal protein was successfully prepared and the titer of antisera was 1∶64 000. Conclusion: The polyclonal antibody against human Glypican3 N-terminal protein was successfully prepared.

　　[Key words] Glypican3; Recombinant protein; Polyclonal antibody;Primary hepatocellular carcinoma

　　Glypican3(磷酯酰肌醇蛋白聚糖3，GPC3) 基因编码的蛋白属于硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖(HSPG)，羧基端通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固定在细胞膜的表面，能与多种细胞外生长因子结合发挥生物学作用。在体内与个体的发育密切相关，并影响肿瘤的发生和发展。其作用机制和生物学功能复杂，可参与细胞增殖、分化、黏附等。最初由Hsu等[1]应用DDRT-PCR技术，从人原发性肝癌组织标本克隆出了全长cDNA，近期研究表明其异常表达与多种肿瘤关系密切[2-4] ，相关研究提示GPC3对肝癌的诊断具有潜在的应用前景。

　　GPC3 N端为可溶性蛋白，其在组织中表达时可能易于分泌入血而被检测，从而用于肿瘤的诊断。我们以前的实验成功构建了人GPC3 N端蛋白原核表达载体，在此基础上本研究诱导表达了融合蛋白，并对融合蛋白进行了纯化，制备了高效价、高特异性的兔抗人GPC3 N端蛋白多克隆抗体，为进一步研究打下了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒PGEX4T-1及大肠杆菌Rosetta均由中国科学院上海神经所保存;PCR试剂盒购自Promega公司;质粒DNA小抽提、DNA凝胶回收及连接试剂盒购自上海华舜生物公司;限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4连接酶，购自Promega公司;引物合成和DNA测序由上海Invitrogen公司提供;谷胱甘肽琼脂糖购自Armersham公司;福氏佐剂、3, 3, 5,5-四甲基联苯胺(TMB)及HRP-山羊抗兔IgG均购自Sigma公司;新西兰纯种大白兔由南通大学实验动物中心提供。其他试剂均为国产或进口分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 GPC3 N端蛋白的表达纯化 从GenBank获取GPC3基因序列，设计出可扩增包含GPC3 N端31～358氨基酸相对应的碱基在内的引物。并分别在上游及下游引物引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，GPC3 N端基因上游引物P1为：5’- ATC GGATCC CCGGACGCCACCTGTCACCAAGTC-3’，下游引物P2为：5’- ATC CTCGAG TCATCTATATTGGCGTTGTTGAGAA-3’。使用小量质粒抽提试剂盒，从我实验室保存的pcDNA3.1-GPC3N重组质粒中提取质粒DNA，并以此为模板行PCR扩增。回收目的片段，并将目的片段及质粒PGEX-4T-1进行双酶切后连接。转化感受态大肠杆菌Rosetta，阳性克隆经测序正确后抽提质粒，再次转化感受态大肠杆菌。在氨苄青霉素LB培养液中以37 ℃、250 r/min转振摇培养至OD600约为0.5。加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，继续以37 ℃、250 r/min震荡培养诱导蛋白表达3 h。诱导后的菌液裂解超声溶解后，上清中GPC3 N端蛋白以谷胱甘肽琼脂糖小珠吸附后洗脱，收集洗脱液中GST-GPC3 N端融合蛋白，详细实验另文报道。

　　1.2.2 多克隆抗体的制备 取800 μg纯化后的融合蛋白GST-GPC3 与弗氏完全佐剂1∶1混匀，充分乳化后，于兔背部皮下多点注射。2周后加强免疫，剂量同上，用不完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射，以后隔2周加强免疫1次。从第3次加强免疫开始，每次免疫后7 d，经耳中央动脉采血测定抗体的效价。经过4次加强免疫后符合要求，立即颈动脉采血，分离血清后，无菌分装保存于-80 ℃备用。

　　1.2.3 辛酸-硫酸铵法纯化抗体 用醋酸钠缓冲液(0.06 mol/L，pH5.0)将抗血清作1∶2稀释，0.1 mol/L HCl调pH至4.5，缓慢滴加辛酸至浓度为0.025 L/L，同时搅拌30 min。4 ℃静置2 h，10 000g离心30 min去沉淀。上清以尼龙网(125 μm)过滤后，加入1/10体积的PBS(0.1 mol/L，pH7.4)，缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45%饱和度，混合后4 ℃过夜。4 ℃，1 000 g离心30 min，弃上清后，用0.01 mol/L PBS(pH7.4)重悬，透析过夜后行蛋白定量。

　　1.2.4 ELISA检测抗血清效价 ELISA检测板用GST-GPC3端融合蛋白以1 mg/L的浓度包被，4 ℃过夜。去抗原后洗涤3次，封闭液37 ℃封闭1 h。按梯度稀释抗血清每孔加入100μl (阴性对照为正常兔血清，空白对照为PBS)，37 ℃孵育1 h洗涤3次后，加入1∶5 000稀释的HRP-羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min洗涤3次后进行TMB显色。终止反应后，酶标仪测定A450的吸光值。

　　1.2.5 Western blot检测多克隆抗体的特异性 将纯化的GST-GPC3端融合蛋白及肝癌组织匀浆上清液进行15 % SDS-PAGE电泳，GST-GPC3端融合蛋白每孔上样0.5 μg，肝癌组织匀浆液(蛋白浓度4.1 mg/ml)每孔上样20 μl，蛋白条带经湿转法电转至硝酸纤维素膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭过夜，分别用免疫前和免疫后兔血清1∶4 000稀释为一抗孵育1 h，洗3次，每次5 min，再用HRP-羊抗兔IgG为二抗，1∶5000稀释孵育1 h，洗3次，每次5 min，化学发光剂试剂处理后，于暗室曝光到X光胶片上，显影、定影。

　　2 结 果

　　2.1 GST-GPC3 N端融合蛋白的表达和纯化结果 负载PGEX-4T-1-GPC3N载体的大肠杆菌Rosetta在加IPTG诱导后，菌株可大量表达分子量为64.48 kDa的GST-GPC3N融合蛋白。重组蛋白经亲和层析纯化后，洗脱液中可得到电泳均一的GST-GPC3N融合蛋白，部分融合蛋白可降解为小片段。洗脱液浓缩后进行15% SDS-PAGE，从凝胶上切出目的条带，切成小块装入透析带，加入适量PBS，水平电泳洗脱2 h。弃去凝胶，留取透析袋中溶液，SDS-PAGE进一步鉴定，可见较纯的单一GST-GPC3N融合蛋白条带(图1)。

　　2.2 ELISA检测多抗效价 见图2。免疫前兔血清与抗原无免疫反应，第3次加强免疫后已有明显的免疫反应，抗体效价可达1∶32 000，在第4次加强免疫后，抗体效价进一步提高，其最终效价可达1∶64 000。

　　2.3 Western blot鉴定多抗的特异性 鉴定结果显示：免疫前血清与抗原无反应，免疫后抗血清纯化后与自身抗原及肝癌组织匀浆中GPC3蛋白有反应，GPC3蛋白质约为580个氨基酸组成，分子量大小约为66 kD，略大于GST-GPC3N融合蛋白，故肝癌组织匀浆中条带略近阴极端(如图3)。

　　3 讨 论

　　肝癌发病率和死亡率以我国为最高，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌，且有升高的趋势[5]，所以肝癌的防治研究显得尤为重要。目前公认的肝癌最佳标志物甲胎蛋白(AFP)在肝癌检出率仅为60%～70%，其它一些肝癌标志物与AFP有互补诊断价值，可提高对肝癌的诊断水平。由于这些标志物在早期肝癌中仍有不少假阴性，且国内尚无检测试剂盒，因此当前迫切需要寻找有助于肝癌早期诊断的特异性标志物，并建立简便、灵敏的检测方法。GPC3基因由8个外显子组成，在启动子区有许多转录因子结合位点,转录子大小为2 130 bp,包括197个碱基的5’非翻译区,编码580个氨基酸的蛋白质-硫酸类肝素蛋白聚糖。研究表明,胎盘和许多胎儿组织中富含GPC3 mRNA，在肝癌组织中GPC3呈高表达，且GPC3的上调会促进肝癌的发展，正常成人肝组织和良性肝病组织无GPC3表达[6-7]。

　　Hippo[8]提出HCC患者血清中多以可溶性GPC3存在,其主要是N端25～358氨基酸,检测血清可溶性GPC3可提高肝癌的诊断敏感性。在抗体制备过程中，把某一抗原免疫某种动物可得到单抗或多抗，若用经免疫过的动物的脾细胞获得杂交瘤细胞，则得到单克隆抗体，如果用动物的血清，则得到多克隆抗体。由于蛋白分子表面具有多种抗原决定簇，免疫动物后，不同的决定簇分别诱导动物产生不同的抗体。单抗是有单个细胞起源的细胞克隆分泌的，所以只针对蛋白抗原的单一抗原决定簇，而多抗是有多个不同克隆的B细胞产生的。多抗混合物中的每一抗体与蛋白抗原结合的能力是不同的，因此用多抗做实验与用单抗可有其优势。它能确保抗体与抗原结合从而显示抗原信息，且多抗的制备方法简便、快捷，成本相对较低。但也有其缺点，那就是交叉反应，往往造成假阳性。本研究中，我们构建了人GPC3 N端融合基因PGEX-4T-1重组载体，诱导表达了GST-GPC3N融合蛋白，为了尽早观察其抗原性，我们首先对其进行了多克隆抗体的制备。GST-GPC3N融合蛋白分子量应约为 64.48 kD，以其为免疫原，免疫新西兰兔，成功制备了抗GPC3N融合蛋白多克隆抗体，并对多克隆抗体行特异性分析，实验结果显示免疫兔产生的抗血清效价达到了1∶64 000。Western blot分析表明,制备的多克隆抗体可特异识别重组表达的GST-GPC3N融合蛋白及肝癌组织匀浆中GPC3蛋白。该抗体的获得对建立GPC3的检测方法，进一步检测其在肝癌组织及血清中的含量也具有重要的意义。

【参考文献】
　　[1] Hsu HC, Cheng W, Lai PL. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution [J]. Cancer Res, 1997,57 (22):5179-5184.

　　[2] Yamanaka K, Ito Y, Okuyama N, et al. Immunohistochemical study of glypican 3 in thyroid cancer [J]. Oncology, 2007,73(5-6):389-394.

　　[3] Nishimura Y, Nakatsura T, Senju S. Usefulness of a novel oncofetal antigen, glypican-3, for diagnosis and immunotherapy of hepatocellular carcinoma[J]. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, 2008,31(5):383-391.

　　[4] Filmus J, Capurro M. The role of glypican-3 in the regulation of body size and cancer[J]. Cell Cycle, 2008,7(18):2787-2790.

　　[5] Befeler AS, Di Bisceglie AM. Hepatocellular carcinoma: diagnosis and treatment[J]. Gastroenterology, 2002,122(6):1609-1619.

　　[6] Kwack MH, Choi BY, Sung YK. Cellular changes resulting from forced expression of glypican-3 in hepatocellular carcinoma cells[J]. Mol Cells, 2006, 21(2):224-228.

　　[7] Capurro M, Wanless IR, Sherman M, et al. Glypican-3: a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2003, 125(1):89-97.

　　[8] Hippo Y, Watanabe K, Watanabe A, et al. Identification of soluble NH2-terminal fragment of glypican-3 as a serological marker for early-stage hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2004,64(7):2418-2423.