内质网应激在高脂血症引起肾脏损害中的作用

　　【摘要】 目的 探讨内质网应激在高脂血症引起的肾脏损害中的作用。方法 40只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC，n=20)和高脂喂养组(HF，n=20)，分别给予普通饲料和高脂饲料喂养。分别于4、8、12、18周时各组随机选取5只大鼠，观察血脂、24h尿蛋白、肾组织病理改变;TUNEL方法检测肾组织细胞凋亡情况;免疫组织化学方法检测肾组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达;RT-PCR方法检测肾组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA的表达。结果 与NC组相比，HF组血脂水平、GRP78 mRNA及蛋白的表达在4、8、12、18周时明显增加(P<0.05);而24h尿蛋白、肾组织细胞凋亡指数及CHOP mRNA的表达在8、12、18周时明显增加(P<0.05)。结论 内质网应激通过CHOP途径参与了高脂血症引起的肾脏损伤。

　　【关键词】 高脂血症;内质网应激;葡萄糖调节蛋白78;CHOP

　　Effect of endoplasmic reticulum stress in renal damage caused by hyperlipidemiaCHANG Xiao-dong, GAN Hua, DU Xiao-gang, CHEN Li-xue　Department of Nephropathy, the First Affiliated Hospital ofChongqing Medical University, Chongqing 400016; the Key Laboratory ofNeurology in Chongqing, Chongqing 400016, ChinaABSTRACT: Objective To investigate the effect of endoplasmic reticulum stress in renal damage caused by hyperlipidemia. Methods Forty male Wistar rats were randomly divided into two groups: normal control group (NC, n=20) and high-fat group (HF, n=20). Rats in NC group were fed with normal diet while those in HF group were fed with high-fat diet. Five rats in each group were randomly chosen in week 4, 8, 12 and 18. Serum lipid, urine protein in 24 hours and the pathological changes of renal tissues were observed; the apoptosis of renal cells was detected by TUNEL staining; the expression of GRP78 protein in the kidney was examined by immunohistochemistry. The expression of GRP78 mRNA and CHOP mRNA was examined by RT-PCR. Results Compared with those in NC group, serum lipid as well as the expression of GRP78 mRNA and protein in the kidney were increased in week 4, 8, 12 and 18 in HF group(P<0.05). In contrast, urine protein in 24 hours, the apoptosis index of renal cells and the expression of CHOP mRNA were increased in week 8, 12 and 18 (P<0.05). Conclusion CHOP pathway of endoplasmic reticulum stress is involved in renal damage caused by hyperlipidemia.

　　KEY WORDS: hyperlipidemia; endoplasmic reticulum stress; glucose-regulated protein 78; CHOP

　　高脂血症不仅是许多肾脏疾病的一种临床表现，还可以作为一种独立的致病因素促进肾功能的恶化[1]，但作用机制还不清楚。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是内质网生理功能发生紊乱的亚细胞器病理状态。内质网应激参与了多种肾病的发生，但是关于其在高脂血症引起的肾脏损害中的作用研究的较少[2]。本研究通过观察高脂血症大鼠肾脏内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78, GRP78)、c/EBP同源蛋白(c/EBP homologous protein, CHOP)，也称为生长阻滞和DNA损伤诱导基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，CHOP/GADD153)表达的改变及与肾实质细胞凋亡的关系，探讨内质网应激在高脂血症引起的肾脏损伤中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组和模型制备

　　4周龄雄性Wistar大鼠40只，体重200～250g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。所有大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(NC)和高脂喂养组(HF)，每组20只。NC组给予普通饲料喂养;HF组给予高脂饲料喂养。高脂饲料配方为100g饲料中含胆固醇2g、猪油10g、胆盐0.5g、蛋黄5g、丙硫氧嘧啶0.2g、基础饲料82.3g。

　　1.2 主要试剂

　　兔抗鼠GRP78多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);SABC免疫组织化学试剂盒、TUNEL试剂盒(武汉博士德);Trizol(Invitrogen公司);Taq酶、DNaseI(RNase free)(TaKaRa公司);M-Mulv反转录酶(Promega公司);引物由上海英骏生物技术公司设计合成。

　　1.3 标本的采集及血脂、24h尿蛋白的检测

　　于4、8、12、18周时各组随机选取5只大鼠，于处死前1d置于代谢笼内收集24h尿液，考马斯亮蓝方法检测24h尿蛋白水平。然后将大鼠用100g/L水合氯醛麻醉后处死，心脏采血，离心后留取血清。采用全自动生化分析仪检测血脂水平。取部分肾组织经40g/L多聚甲醛固定。其余肾组织液氮速冻后-70℃保存，用于RT-PCR分析。

　　1.4 肾组织病理学检查

　　取40g/L多聚甲醛固定标本，经脱水、石蜡包埋、切片(4μm)后，行HE染色，于光学显微镜下观察肾组织病理学改变。

　　1.5 肾组织凋亡细胞测定

　　应用TUNEL技术检测凋亡细胞，按照TUNEL试剂盒说明进行操作。光学显微镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。每张切片选取5个视野，在200倍光镜下计数阳性细胞数，并计算凋亡指数。凋亡指数=(阳性细胞数/计数细胞总数)×100%。

　　1.6 免疫组织化学检测大鼠肾组织GRP78蛋白表达和分布

　　石蜡切片常规脱蜡至水，30mL/L H2O2封闭过氧化物酶。抗GRP78多克隆抗体用PBS 1∶100稀释，根据SABC免疫组织化学试剂盒所示方法检测肾小球GRP78蛋白表达，常规设立阴性对照。在光学显微镜下观察GRP78在大鼠肾组织的表达情况，并摄片。采用北航医学图像分析系统(4.0)对结果进行分析，以单位面积密度值表示GRP78蛋白表达情况。

　　1.7 肾组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达的检测

　　采用RT-PCR法。Trizol提取肾组织总RNA，M-Mulv反转录酶逆转录RNA为cDNA，在PCR仪(美国ABI公司)上进行扩增。GRP78引物序列：上游5′-CTGGCACTATTGCTGGACTG-3′，下游5′-GCACCATATGCTACAGCCTC-3′，产物长度为634bp，退火温度为57℃，经32个循环。CHOP引物序列：上游5′-CGCCTTCAACGACGAGTTCCTG-3′，下游5′-GCTGTTCTTATCCACCGACTTC-3′，产物长度620bp，退火温度为56℃，经32个循环。内参照物β-actin引物序列：上游5′-GTCAGAAGGACTCCTACGTG-3′，下游5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′，产物长度825bp，退火温度为53℃，经28个循环。PCR产物在10g/L琼脂糖上进行凝胶电泳。应用凝胶成像系统摄取各样品电泳图,通过成像分析软件进行半定量分析。

　　1.8 统计学分析

　　全部计量资料用±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。多组计量资料经检验方差齐同，采用单因素方差分析，两组资料比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 血脂变化

　　NC组大鼠血清三酰甘油(triglycerides, TG)、胆固醇(cholesterol, TC)水平在各个时间点无明显改变(P>0.05)。HF组大鼠血清TC、TG水平在4、8、12、18周时较同期NC组明显升高(P<0.05)。各组大鼠不同时间点血脂水平见表1。表1 各组大鼠血清三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)水平(略)与同时间正常对照组比较，▲P<0.05。

　　2.2 尿蛋白改变

　　NC组大鼠各个时间点24h尿蛋白无明显改变。HF组大鼠24h尿蛋白自8周起，逐渐增加,且在8、12、18周时24h尿蛋白较同一时间点NC组大鼠明显增高(P<0.05，图1)。

　　2.3 肾组织病理变化

　　第18周时，大鼠肾组织HE染色结果显示：NC组肾小球结构清晰，未发现毛细血管球分叶，无系膜区增生(图2A);HF组肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基质增多，HE染色加深(图2B)。

　　2.4 肾组织中凋亡细胞的检测

　　NC组大鼠肾组织在各个时间点细胞凋亡不明显。HF组大鼠4周时肾组织可见少许凋亡细胞(P>0.05)，在8、12、18周时肾组织凋亡细胞较NC组明显增多(P<0.05，表2)。各组大鼠4、18周时肾组织TUNEL染色结果见图3。表2 各组大鼠肾组织细胞凋亡指数比较(略)与同时间正常对照组比较，▲P<0.05。

　　2.5 肾组织中GRP78蛋白的表达

　　GRP78蛋白主要表达于肾小管，肾小球中仅有少量表达。NC组大鼠各个时间点肾组织GRP78蛋白表达较弱。4周时，HF组大鼠肾组织GRP78蛋白表达较NC组增加(P<0.05), 随着时间延长，其表达逐渐增强(表3、图4)。表3 各组大鼠肾组织GRP78蛋白表达(略)与同时间正常对照组比较，*P<0.05;与4周高脂喂养组比较，▲P<0.05。

　　2.6 各组大鼠肾组织GRP78 mRNA、CHOP mRNA的表达

　　各组大鼠肾组织GRP78 mRNA、CHOP mRNA在各个时间点表达情况见图5、图6。NC组大鼠肾组织GRP78 mRNA、CHOP mRNA在各个时间点表达较弱。HF组大鼠肾组织GRP78 mRNA表达在4、8、12、18周时较NC组明显增强(P<0.05);而CHOP mRNA的表达在4周时不明显，在8、12、18周时较NC组增强(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　自1982年，MOORHEAD首次提出“脂质肾毒性”假说以来，关于高脂血症在肾脏损害中的作用越来越引起人们的重视。高脂血症引起肾脏损害的机制除与巨噬细胞的浸润、泡沫细胞的形成、细胞外基质的沉积有关外，肾实质细胞凋亡在脂质引起的肾脏损害中也起着重要的作用[3]。本研究发现：大鼠经高脂饲料喂养18周后，24h尿蛋白明显增加;肾组织系膜区增宽，细胞外基质增多，同时凋亡细胞也明显增多。这进一步证实了肾实质细胞凋亡在高脂血症引起的肾脏损伤中起着重要的作用。

　　内质网对真核细胞蛋白质的合成、翻译后的修饰、折叠组装有着重要的作用。缺氧、氧化应激、钙超载等可引起内质网的功能紊乱，导致非折叠蛋白的聚集，引发内质网应激反应。在早期，内质网可以激活非折叠蛋白反应(unfolded protein response, URP)，减轻内质网应激引起的细胞损伤，包括暂停蛋白质的合成、促进非折叠蛋白的降解及内质网分子伴侣的表达增加。但是持续的内质网应激会引起细胞的凋亡[4]。内质网分子伴侣的表达增加在内质网应激反应中起着重要的作用。GRP78是内质网一种特异的分子伴侣，又称为免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin binding protein, Bip)，属于热休克蛋白70家族，其对蛋白质的正确折叠及内质网稳态的维持有着重要的作用，其表达异常可明显加重内质网应激引起的细胞损伤[5]。因此，GRP78的表达上调可以作为内质网应激的敏感标志。已有研究表明：高血糖、补体、蛋白尿等引起的肾实质细胞凋亡中均有内质网应激的参与[6-8]。本研究发现大鼠经高脂饲料喂养4周后，肾组织GRP78 mRNA及蛋白的表达较对照组明显增加，在18周时表达最高。这说明长期的高脂血症可以引起肾脏的内质网应激反应，进而引起肾实质细胞的凋亡。

　　研究发现有三种途径参与了内质网应激引起的细胞凋亡，即CHOP/GADD153基因的激活转录、c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)激活和半胱氨酸蛋白酶Capase-12的激活。CHOP途径是内质网应激凋亡途径中比较特异性的途径。CHOP/GADD153属促凋亡转录因子，其可以通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2而引起细胞的凋亡[9]。CHOP在生理情况下表达较少，内质网应激时其表达显著增加。ZINSZNER等[10]研究发现，在内质网应激条件下，CHOP基因缺陷细胞很少引起凋亡。这说明了CHOP途径的激活在内质网应激引起的细胞凋亡中起着重要的作用。本研究发现：高脂喂养组大鼠肾脏CHOP mRNA的表达在8周时较对照组增加，以后随时间延长，其表达逐渐增强;并且随着其表达的增加，肾组织凋亡细胞也明显增加。这说明高脂血症可以通过内质网应激CHOP通路激活引起肾实质细胞的凋亡，进而引起肾脏的损伤。

　　总之，本实验通过建立大鼠高脂血症模型，研究发现长期的高脂血症可以通过内质网应激CHOP通路的激活而引起肾脏的损伤。提示通过阻止内质网应激凋亡途径的激活可能减轻高脂血症引起的肾脏损伤。这为肾脏疾病的治疗提供了新的思路，但具体机制还有待进一步研究。

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　　[10]ZINSZNER H, KURODA M, WANG X, et al. CHOP is implicated in programmed cell death in response to impaired function of the endoplasmic reticulum [J]. Genes Dev, 1998, 12(7):982-995.