祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球基底膜阴离子位点的影响

　　【摘要】 目的 观察祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球基底膜(GBM)上阴离子位点(AS)的影响。方法 尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病(AN)大鼠模型，并随机分为A(空白组)、B(模型组)、C(祛风通络方组)、D(激素+祛风通络方组)、E(激素组)、F(苯那普利组)组，并给予相应干预;第3、7周留取肾皮质，以醋酸铀和柠檬酸铅双重染色法，透射电镜观察GBM的超微结构;以PEI示踪染色电镜观察GBM上AS的分布变化。结果 ①3周时与A组相比，模型组大鼠24h尿蛋白显著升高(P<0.01)，血清ALB明显下降(P<0.01)，血清TG和TCH明显升高(P<0.01);②3周时透射电镜示模型组大鼠肾小球足突呈部分或弥漫性融合，GBM上AS明显减少;③7周时与B组相比，C、E组超微结构明显改善，AS分布呈连续点线状分布，平均AS表达量增强(P<0.01)。结论 祛风通络方可通过改善GBM上AS的表达与分布而修复肾小球电荷屏障。

　　【关键词】 阿霉素肾病;蛋白尿;阴离子位点;祛风通络方

　　Effects of Qufengtongluo Recipe on anionic site in glomerular　basement membrane in adriamycin-induced nephropathy ratsREN Yan-yun, SUN Wan-sen, ZHAO Yan-long, MA Qiao-ya, WANG ZhuDepartment of Traditional and Western Medicine, the Second Affiliated Hospital,dical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, ChinaABSTRACT: Objective To investigate the expression of anionic site in adriamycin-induced nephropathy (AN) rats, and to further explore the effects of Qufengtongluo Recipe on charge barrier in glomerulus in AN rats. Methods Adriamycin nephropathy was induced by a single tail intravenous injection of adriamycin. Totally 80 rats were randomly divided into normal control group and nephropathy model group. Three weeks later, the nephropathy model was established, and 50 AN rats were randomly divided into five groups: nephropathy model group (B, n=10), Qufeng group (C, n=10), prednisone and Qufeng group (D, n=10), prednisone group (E, n=10) and benazepri group (F, n=10), and they were treated respectively. With treatment being given respectively, renal tissue samples in each group were collected at week 3 and 7, respectively. The ultrastructure and expression of anionic site were examined by electron microscope observation. Results ① After adriamycin injection, a significant increase of the 24-hour urinary protein was observed at week 3 (P<0.01). In AN rats, serum albumin was decreased (P<0.01) while serum TCH and TG were increased (P<0.01). ② In AN rats the diffuse fusion and effacement of foot processes and decrease of anionic sites in GBM were observed at week 3. ③ At week 7, the average intensity of AS dramatically increased in C and E groups (P<0.01) compared with that in nephropathy model group. Conclusion The abnormal expression of AS is the important mechanism that leads to the occurrence and development of proteinuria in AN rats. It is possible that Qufengtongluo Recipe has effects on nephrotic syndrome through altering the charge barrier in GBM in glomerulus.

　　KEY WORDS: adriamycin nephropathy; proteinuria; anionic site; Qufengtongluo Recipe

　　肾性蛋白尿的发生由肾小球滤过膜的机械屏障和电荷屏障损伤所致，肾小球毛细血管壁的电荷选择性通透性的变化是其发生的主要原因。肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)通过表面丰富的阴离子电荷和网络样小孔径筛网结构发挥电荷屏障和孔径屏障的功能。GBM上阴离子位点(anionic sites, AS)的变化可以有效反应肾小球滤过膜电荷屏障的功能状态。祛风通络方是在“风伏肾络”[1]的病机理论指导下组成的中药复方，用于肾病临床多年，效果可靠。本研究通过PEI示踪法观察祛风通络方对阿霉素肾病(adriamycin nephropathy, AN)大鼠GBM超微结构和AS的表达的影响，为祛风通络方的临床应用提供新的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、模型制备及分组

　　健康雄性清洁级SD大鼠80只，体重(200±20)g，饲养于西安交通大学医学院实验动物SPF中心。随机抽出16只大鼠，作为空白组(A组，n=16)，尾静脉注射等容量生理盐水;余下的64只大鼠一次性尾静脉注射阿霉素6mg/kg体重，制备病理模型，3周后50只造模成功。剔除死亡及不合格模型动物后，将50只AN大鼠随机分为：模型组(B组，n=10)、祛风通络方组(C组，n=10)、激祛组(激素和祛风通络方共用，D组，n=10)、激素组(E组，n=10)、苯那普利组(F组，n=10)。第3周起各组每日灌胃1次：A组和B组蒸馏水2mL;C组祛风通络方(含生药2.1g/mL)药液1mL和蒸馏水1mL;D组强的松(25mg/kg)药液1mL和祛风通络方药液1mL;E组强的松药液1mL和蒸馏水1mL;F组苯那普利(0.34mg/kg)1mL和蒸馏水1mL。将空白组和模型组各处死8只大鼠，监测相应指标。实验期间每周检测尿蛋白1次，造模成功及实验结束后各检测1次血清生化指标、超微结构及AS的变化。

　　1.2 主要试剂及设备

　　中药，西安易圣堂大药堂;醋酸强的松，西安利君制药有限公司;苯那普利，北京诺华制药有限公司;阿霉素，浙江海正药业有限公司;聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)，美国Sigma公司;H-600透射电子显微镜，日本日立公司。

　　1.3 尿蛋白及血清学指标的测定

　　用邻苯三酚红/钼酸盐测定24h尿蛋白定量;用全自动生化分析仪测定血清白蛋白(ALB)、血脂(TCH、TG)和肾功(Bun、Cr)。

　　1.4 透射电镜观察

　　1.4.1 肾小球超微结构的观察

　　取约1mm×1mm×1mm的肾皮质组织块，25mL/L戊二醛4℃固定，10g/L四氧化锇酸后固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂与丙酮包埋，聚合成块，超薄切片(50～70nm)后醋酸铀-柠檬酸铅染色，透射电镜观察、摄片。

　　1.4.2 肾小球基底膜上AS的检测

　　取1mm×1mm×1mm新鲜肾皮质，5g/L PEI浸泡染色30min，二甲胂酸钠缓冲液冲洗;用戊二醛-磷钨酸混合液常温固定30min，锇酸后固定;脱水、包埋、聚合，超薄切片，透射电镜观察、摄片。AS计数时只用GBM平直的片段，从测定的GBM长度和计数的AS数，计算出平均每1000nm GBM内、外疏松层上的AS数。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理。计数资料用(±s)表示，组间比较采用两因素方差分析，多重比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 24h尿蛋白定量

　　阿霉素尾静脉注射后，模型组大鼠的24h尿蛋白定量逐渐增多。3周时与空白组比较，造模组大鼠的24h尿蛋白明显升高(P<0.01)，提示造模成功(表1)。造模组大鼠第3周起给予相应干预，每周尿蛋白水平变化见表2。表1 大鼠造模成功前每周尿蛋白的变化(略)与空白组比较，*P<0.01。表2 大鼠造模成功后各组每周尿蛋白的变化(略)

　　2.2 生化检测结果

　　3周时与空白组比较,AN组大鼠的ALB降低，TCH与TG明显升高(P<0.01，表3);第7周干预结束后，各组大鼠血液生化指标见表4。与B组比较，C组ALB有一定程度上升，但无统计学意义，E组ALB下降明显(P<0.05);各干预组TCH均有明显改善(P<0.05);各干预组TG下降不明显，激素组反呈现明显升高趋势(P<0.05)。表3 大鼠造模成功时血清生化指标的变化(略)与空白组比较，*P<0.01。A：空白组;B：模型组。表4 各组大鼠7周时血液生化指标的变化(略)

　　2.3 肾小球GBM的超微结构观察

　　透射电镜下可见，正常大鼠GBM结构良好，足突排列整齐清晰，内皮孔清晰可见。3周时可见GBM上足突增宽、部分或弥漫性融合甚至消失，足细胞有肿胀、细胞数明显减少，表示造模成功。干预结束与B组比较，各治疗组上述病变不同程度得到改善，足突结构清晰、足突数目增多，其中C、E组改善明显(图1)。

　　2.4 肾小球GBM上AS的检测结果

　　PEI示踪的AS在透射电镜下呈颗粒状，沿着GBM和足突的形态分布。空白组大鼠GBM上PEI染色颗粒致密、大小规则，呈点线样分布;颗粒分布以单层和双层排列为多见，仅在少数GBM节段上可见3层排列，颗粒主要分布在外疏松层，内疏松层可见少数PEI颗粒，但着色浅，排列和大小不规则。模型组大鼠GBM上PEI染色颗粒数量明显减少，间距显著增大并伴有颗粒丢失，部分GBM显示不清晰，足突溶解融合。干预结束后，各组大鼠GBM上PEI染色颗粒均有所上调，其中C、E组上调明显，排列较规则;D组大鼠PEI着色较深，F组颗粒数量与B组无明显差异(图2)。对药物干预后所有PEI染色的电镜标本AS进行定量(个/1000nm GBM)分析，结果显示，干预结束后与B组比较，C、D、E组大鼠GBM上PEI染色颗粒计数明显增多(P<0.01)，F组颗粒数量则无明显差异(表5)。表5 各组大鼠实验7周时的AS计数(略)与A组比较，#P<0.01;与B组比较，**P<0.01。

　　3 讨 论

　　肾小球滤过屏障由血管内皮细胞、GBM及足细胞间的裂隙膜组成。GBM为一满布负电荷的筛网，能限制大分子蛋白质及带负电荷的物质通过，其重要的结构功能蛋白——硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)带负电荷而发挥其分子屏障和电荷屏障的功能。电荷屏障由肾小球的多阴离子及GBM上的AS两部分组成。多阴离子主要是位于肾小球上皮细胞及内皮细胞表面的涎糖蛋白,带阴电荷成分主要是涎酸;GBM上的AS则由内、外疏松层的HSPG组成。研究显示，GBM上AS减少主要与HSPG的核心蛋白Perlecan和其HS侧链减少以及Agrin蛋白的减少有关[2]。用PEI染色和阳离子胶体金技术对AN模型的研究发现，肾小球固定阴电荷明显减少，可能与NO的调节有关[3]。在Heymann肾炎大鼠模型中，用PEI染色也发现AS位点明显减少，与白蛋白的丢失明显相关[4]。因此，研究GBM上AS的变化对于肾小球电荷屏障的结构和功能有着重要的意义。

　　PEI是强阳离子大分子聚合物，其染色途径多样，能保持肾小球超微结构稳定，可与带负电荷基团在原位结合,且不仅能结合GBM上的AS，也可结合系膜区、小管基底膜和间质中的AS[5]。其与重金属络合成密度较高的细颗粒, 在透射电镜下可测定其大小、间距和分布，已广泛用于电荷屏障的研究。用PEI示踪发现STZ诱导糖尿病大鼠GBM明显增厚，但GBM上AS显著减少,胰岛素治疗或噻唑烷二酮干预可以阻止AS减少，即可有效修复GBM电荷屏障，降低尿白蛋白排泄率[6-7]。肾脏缺血再灌注后造成的肾脏损伤亦可通过此法观察到GBM上AS显著减少[8]。恰当的中西医结合防治能有效地修复AN大鼠GBM电荷屏障[9-10]。

　　中药制剂在防治肾病蛋白尿方面有一定的优势。本研究结果显示，祛风组、激素组在修复GBM上AS方面疗效显著，而激素加祛风组、苯那普利组则疗效稍差，提示祛风通络方能够有效防治蛋白尿，改善AN大鼠的相关生化指标和GBM上AS的表达和分布异常，从而有效修复AN大鼠GBM电荷屏障。其机理可能为：该方良好的免疫调节作用抑制了AN大鼠的GBM及足细胞损伤;改善GBM相关蛋白HSPG和其HS侧链的表达，从根本上修复GBM电荷屏障;其抗炎抗凝作用亦可改善AN大鼠的炎性介导损伤及GBM的血供。祛风通络方(乌梢蛇、海风藤、防风、黄芪、桑寄生、生地)是在长期临床应用的基础上加减而成。作者认为肾病病因病机之一是风邪伏于空虚之肾络，久而肾络瘀滞不通，发为肾病，此即“风伏肾络”病机。治疗以祛肾络之风邪为主，兼补肾络之虚损和通肾络之瘀滞，创立祛风通络方剂。方中乌梢蛇祛风通络为君药;海风藤、防风祛风胜湿通络为臣药;佐以黄芪益气祛风通络，桑寄生滋肾祛风湿;使以生地养阴生津，既防诸药之燥，又引诸药入肾经。全方体现祛风通络、益气补肾之功。药理研究认为，乌梢蛇具有抗炎作用;海风藤具有抗炎及免疫抑制及抗内毒素作用;而黄芪具有改善全身血流动力学，调节机体免疫机能等作用。该方所体现的免疫调节、抗凝、溶栓及抗增生作用亦符合肾病病理机制。前期研究也显示，本方对大鼠肾小球系膜细胞的增殖及其TGF-β1和IL-6的mRNA表达有明显的抑制作用，对增殖性肾炎有着良好的应用前景[11]。临床应用本方，没有皮质激素的副作用，适合长期使用。

　　综上所述，通过PEI示踪染色对AN大鼠AS表达和分布的研究，证实了AN大鼠GBM上AS与蛋白尿之间的相关性。AS是GBM电荷屏障功能正常的重要标志之一，祛风通络方可能通过改善AN大鼠GBM上HSPG的表达而改善AS的表达和分布，修复GBM电荷屏障，从而起到防治肾性蛋白尿的作用。但其影响基底膜相关蛋白之间的信号转导以及内在的调节机制还有待深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]孙万森，吴喜利，乔成林，等. 通络胶囊治疗糖尿病肾病慢性肾衰竭的临床研究 [J]. 中国中西医结合杂志, 2004, 24(8):704-706.

　　[2]GOLDBERG S, HARVEY SJ, CUNNINGHAM J, et al. Glomerular filtration is normal in the absence of both agrin and perlecan-heparan sulfate from the glomerular basement membrane [J]. Nephrol Dial Transplant, 2009, 14. [ahead of print]

　　[3]HERTZAN-LEVY S, FISH R, SKUTELSKY E, et al. Glomerular basement membrane anionic sites in adriamycin nephropathy: effect of saline loading and nitric oxide modulation [J]. Nephron, 2000, 84(4):354-361.

　　[4]FUJIGAKI Y, BATSFORD S, YAMASHITA F, et al. Sequence of events in the glomerular capillary wall at the onset of proteinuria in passive Heymann nephritis [J]. Virchows Arch, 2001, 438(2):136-145.

　　[5]邢玲玲，傅淑霞. 肾小球阴电荷的检测方法及临床意义 [J]. 河北医科大学学报, 2004, 25(5):319-321.

　　[6]ISOGAI S, MOGAMI K, OUCHI H, et al. An impairment of barrier size and charge selectivity of glomerular basement membrane in streptozotocin-induced diabetes and prevention by pharmacological therapy [J]. Med Electron Microsc, 2000, 33(3):123-129.

　　[7]YAMASHITA H, NAGAI Y, TAKAMURA T, et al. Thiazolidinedione derivatives ameliorate albuminuria in streptozotocin-induced diabetic spontaneous hypertensive rat [J]. Metabolism, 2002, 51(4):403-408.

　　[8]王新良，王新颖，牟兆新，等. 肾缺血再灌注对大鼠肾小球超微结构及负电荷位点的影响[J]. 河北医科大学学报, 2005, 26(5):321-323.

　　[9]李维军，王健，章文平. 通肾汤对肾小球基底膜阴离子位点的影响 [J]. 江西中医学院学报, 2004, 16(5):46.

　　[10]鲁艳芳，袁军，林丽，等. 中西医结合对肾病模型肾小球基底膜阴离子位点的影响 [J].中医研究, 2005, 19(4):11-14.

　　[11]孙万森，王竹，王娟，等. 祛风通络方对大鼠系膜细胞增殖及转化生长因子-β1和白细胞介素-6 mRNA表达的影响 [J]. 中西医结合学报, 2008, 6(9):915-920.