三氧化二砷诱导人胃癌裸鼠移植瘤细胞凋亡及其对Fas/FasL表达的影响

　　【摘要】 目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对Fas/FasL表达的影响及其在诱导肿瘤细胞凋亡中的作用。方法 雄性BALB/C-nu/nu裸鼠30只，建立人胃癌裸鼠移植瘤模型后，随机分为3组，即对照组、As2O3低剂量组和As2O3高剂量组。As2O3低剂量组和高剂量组分别按2.5mg/kg和5mg/kg剂量给予As2O3腹腔注射治疗;对照组给予等体积生理盐水。测量瘤块体积观察肿瘤的生长情况;采用电镜观察和原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞的凋亡情况;采用免疫组化法检测Fas/FasL的表达。结果 As2O3治疗组瘤块的平均体积均显著小于对照组(P<0.05);As2O3治疗组肿瘤组织中凋亡细胞的数量较对照组显著增多(P<0.01);As2O3治疗组肿瘤细胞的Fas表达显著高于对照组(P<0.05)，但FasL的表达两组间无显著性差异(P>0.05)。结论 As2O3对人胃癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其机制可能与上调Fas表达、诱导胃癌细胞凋亡有关。

　　【关键词】 三氧化二砷;胃癌;裸鼠;Fas/FasL;凋亡

　　Effect of arsenic trioxide in inducing apoptosis and expression of　Fas/FasL of gastric tumor cells in nude miceWU De-dong, XIAO Yan-feng, YAO Ding-shuDepartment of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian710004, ChinaABSTRACT: Objective To study the effect of arsenic trioxide (As2O3) on the expression of Fas/FasL and in inducing apoptosis of gastric tumor cells in nude mice. Methods The xenograft model was established in 30 male BALB/C-nu/nu mice. The mice were randomly divided into 3 groups and injected intraperitoneally with As2O3 (2.5mg/kg or 5mg/kg) or with saline solution of the same volume respectively. Tumor growth was detected by measuring tumor volume. Apoptosis of the tumor cells was measured with transmission electron microscope (TEM) and TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The expression of Fas/FasL in the tumor cells was detected with immunohistochemistry. Results Tumor volume in As2O3-treated groups was smaller than that in control group (P<0.05). Apoptotic cells in the As2O3-treated groups significantly outnumbered than those in control group (P<0.01). The expression of Fas in tumor cells was higher in the As2O3-treated groups than in control group (P<0.05), but FasL expression of tumor cells did not differ between the treated groups and control group (P>0.05). Conclusion As2O3 can obviously inhibit the growth of human gastric tumor. One of the mechanisms is up-regulation of Fas gene that can induce the apoptosis of gastric cells.

　　KEY WORDS: arsenic trioxide; gastric cancer; nude mice; Fas/FasL; apoptosis

　　三氧化二砷(As2O3)临床治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)获得的显著疗效，引起人们对As2O3的高度关注和重新认识。深入研究发现，As2O3能够延长细胞周期，影响凋亡相关基因的表达。诱导肿瘤细胞分化和凋亡可能是As2O3抗肿瘤的主要机制[1-2]。细胞凋亡途径主要为两条，即线粒体途径和死亡受体途径。目前，对砷剂诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究主要集中在线粒体途径上，而对其诱导肿瘤细胞凋亡的作用是否依赖Fas/FasL系统，报道较少。本研究以SGC7901(人淋巴结转移性胃腺癌)细胞在裸鼠皮下建立胃癌模型，用不同剂量的As2O3腹腔注射，探讨As2O3的抗癌作用及其诱导凋亡的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及细胞株

　　亚砷酸(主要成分为As2O3)购自哈尔滨伊达药业有限公司;TUNEL凋亡试剂盒购自德国Roche公司;兔抗人Fas和FasL多克隆抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品;人胃癌SGC7901细胞购自第四军医大学实验动物中心。

　　1.2 人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立和分组

　　30只BALB/C-nu/nu裸鼠，雄性，5周龄，体重19～21g，在SPF条件下饲养。在无菌条件下，每只裸鼠于右后肢背部皮下注射4×106个人胃癌SGC7901细胞(0.2mL)，接种10d后，裸鼠均形成瘤节。随即将30只裸鼠随机分为对照组及As2O3低、高剂量治疗组3组。As2O3低剂量组和高剂量组分别按2.5mg/kg和5mg/kg剂量给予As2O3腹腔注射治疗;对照组给予等体积生理盐水。连续给药10d。

　　1.3 抑瘤率的计算

　　于给药第0、6、11天分别测量瘤块的长径(a)、短径(b)，瘤块体积(cm3)=1/2ab2，抑瘤率=(1-治疗组瘤块平均体积/对照组瘤块平均体积)×100%。同时留取各组的肝、肾组织。

　　1.4 组织标本的制备和电镜观察

　　治疗结束次日，每组取2只裸鼠，每只裸鼠腹腔注射1g/L戊巴比妥钠进行麻醉，用刮胡刀片从每个瘤块中游离出体积约1mm3的瘤组织，放入25g/L戊二醛中固定，供电镜用。所有裸鼠取出瘤组织，放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，制备冰冻切片供TUNEL法检测凋亡用，制备石蜡切片供HE染色或免疫组化检测Fas/FasL用;取出裸鼠的肝、肾放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，制备石蜡切片供HE染色用。

　　按常规透射电镜制样方法固定、包埋和染色，于H-600型透射电镜下观察细胞凋亡情况并拍照。

　　1.5 TUNEL法检测细胞凋亡情况

　　严格按试剂盒说明书步骤进行。结果判定：Leica激光显微镜下、515～565nm绿光观察，每个样本在凋亡细胞较集中的区域(凋亡热区)取10个400倍视野，用Leica Confocal软件测量其荧光强度，该10个视野荧光强度的平均值分别为每个样本的荧光强度值。

　　1.6 免疫组化法检测Fas、FasL蛋白的表达

　　按SP免疫组化染色试剂盒说明书操作。结果判定：每个样本在Fas/FasL高表达区域取10个400倍视野，用Leica图像信号采集与分析系统测量其灰度，该10个视野灰度的平均值分别为每个样本的灰度值。

　　1.7 统计学处理

　　应用SPSS10.0统计软件处理数据，计量资料数据采用均数±标准差表示。多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析，各组均数间两两比较用Student-Newman-Kewls法。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 裸鼠移植瘤的生长情况及As2O3的抑瘤率

　　30只裸鼠在接种胃癌细胞10d后均形成结节，全部成瘤。给药前3组间瘤块的平均体积没有显著性差异(P>0.05);给药第6天3组间瘤块的平均体积仍然没有显著性差异(P>0.05);给药第11天(治疗结束次日)两个治疗组瘤块的平均体积均显著小于对照组(P<0.05)，且高剂量治疗组显著小于低剂量治疗组(P<0.05，表1);用瘤重来计算得到同样的结果。治疗组与对照组相比，裸鼠的肝、肾组织无明显病理损害。表1 As2O3对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用(略)与对照组比较，*P<0.05;与As2O3低剂量组比较，△P<0.05。

　　2.2 透射电镜下肿瘤细胞的凋亡情况

　　对照组呈典型的瘤细胞表现，瘤细胞大小不一，形态不规则，胞核较大，多核仁，核仁大小不一，核仁有不居中现象甚至边集;凋亡细胞极少见。低剂量治疗组可见凋亡细胞，但比高剂量治疗组少，且典型的“凋亡小体”极少见;高剂量组可见较多的凋亡细胞，染色质浓染边集，有的正在或已经被周围的细胞所吞噬，凋亡细胞集中的区域可见典型的“凋亡小体”。治疗组可见典型的坏死细胞(图1)。

　　2.3 TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况

　　激光共聚焦显微镜下(400倍)，被荧光着色的是凋亡细胞。治疗组尤其是高剂量组凋亡细胞较多，对照组凋亡细胞较少，且凋亡细胞有集中分布现象(图2)。采用LeiCa Confocal软件定量分析3组肿瘤凋亡细胞的荧光强度。结果显示，对照组的荧光强度为12.49±3.22，2.5mg/kg As2O3组和5mg/kg As2O3组的荧光强度分别为25.74±3.82和85.39±8.92，对照组分别与治疗组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。表2 As2O3治疗组和对照组Fas、FasL表达的比较(略)与对照组比较，*P<0.05;灰度值越低说明表达越高。

　　3 讨 论

　　抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡已成为肿瘤化疗的策略之一。Fas/FasL为凋亡相关基因，其表达失衡是一些疾病发生发展的重要原因之一。肿瘤的发生、发展与Fas/FasL表达失衡密切相关[3-4]。

　　刘灿均等[5]的研究显示，Fas在癌变黏膜中表达率明显低于癌前病变及正常黏膜，这提示Fas表达的下调及细胞凋亡的减少可能对胃癌的发生发展有着重要意义。化疗药物通过诱导低表达Fas的肿瘤细胞功能性Fas高表达，使肿瘤细胞凋亡增加，已成为肿瘤化疗的思路之一。As2O3诱导肿瘤细胞凋亡在内、外实验中都得到了验证，然而这一过程是否依赖Fas/FasL系统目前尚存在争议。通过细胞培养的方法，ROJEWSKI等[6]的研究表明，As2O3诱导的CCRF-CEM和Jurkat细胞凋亡不依赖Fas/FasL系统;而ZHU等[7]的研究则证明，As2O3诱导RL和HL-60细胞凋亡依赖Fas/FasL系统。

　　本研究结果显示，As2O3对人胃癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用。光镜、电镜下观察及TUNEL检测都表明治疗组胃癌细胞的凋亡明显多于对照组，且凋亡细胞有集中分布现象;治疗组Fas的表达也明显高于对照组，并有集中高表达现象。由于本研究结合电镜、TUNEL及免疫组化等形态学定位的优势，证明胃癌细胞凋亡集中的区域恰恰是Fas高表达的区域，也就是说胃癌细胞凋亡的增加与Fas表达的上调有关。这比其他通过细胞培养或流式细胞计数得到的结果更为可靠、直观。邬万新等[8]通过原位观察胃癌细胞的Fas/FasL表达和凋亡情况，并结合胃癌的临床病理特征，结果显示Fas(+)/FasL(+)组和Fas(+)/FasL(-)组之间的凋亡数量无差异，从而推论肿瘤细胞自身表达的FasL并不能增加肿瘤细胞的凋亡，只有表达FasL的淋巴细胞才能使表达Fas的细胞凋亡。这与本研究结果不符。因为裸鼠T细胞缺陷，只有极少量的巨噬细胞、NK细胞等肿瘤杀伤细胞浸润到肿瘤组织，而在Fas高表达区域有大量的胃癌细胞凋亡，如果胃癌细胞自身表达的FasL不参与其凋亡，就很难有大量的胃癌细胞集中发生片状凋亡。本研究从形态学定位的角度证明胃癌细胞凋亡的增加与其Fas表达的上调密不可分，由此推论：①细胞表面Fas的表达只有上调到一定程度才能发生凋亡;②肿瘤细胞的凋亡可能不是孤立行为，发生凋亡的细胞会影响其周围细胞的生存状态;③肿瘤细胞凋亡集中的区域也是肿瘤细胞高增殖的区域，As2O3诱导高增殖的肿瘤细胞高表达Fas，继而诱导其凋亡。肿瘤细胞表达的FasL不仅引起肿瘤细胞自身凋亡，亦可作用于免疫系统，造成表达Fas的免疫细胞凋亡，造成肿瘤细胞的免疫逃逸。本研究结果显示，经As2O3化疗后，胃癌移植瘤FasL的表达无明显变化， 即As2O3化疗不会增加胃癌细胞的免疫逃逸。因为本实验为体内实验，虽然裸鼠缺乏T细胞，但仍然有少量的巨噬细胞、NK细胞等肿瘤杀伤细胞。这一结果提示，As2O3抗人胃癌的过程可能不会增加免疫逃逸。

　　此外，以前的研究显示As2O3能显著诱导NB4细胞凋亡而并不依赖Fas/FasL系统，因为NB4细胞表面没有Fas表达[9]。ZHU等[7]的研究也显示，封闭肿瘤细胞表面Fas，只能部分抑制As2O3诱导的肿瘤细胞凋亡，并不能完全阻止其凋亡。这说明As2O3诱导肿瘤细胞凋亡，除了依赖Fas/FasL系统外，还可能有其他途径。

　　【参考文献】

　　1]MILLER WH, SCHIPPER HM, LEE JS, et al. Mechanisms of action of arsenic trioxide [J]. Cancer Res, 2002, 62(14):3893-3903.

　　[2]WAXMAN S, ANDERSON KC. History of the development of arsenic derivatives in cancer therapy [J]. Oncologist, 2001, 6(suppl 2):3-10.

　　[3]OBRIEN DI, NALLY K, KELLY RG, et al. Targeting the Fas/Fas ligand pathway in cancer [J]. Expert Opin Ther Targets, 2005, 9(5):1031-1044.

　　[4]BEBENEK M, DUS D, KOZLAK J. Fas and Fas ligand as prognostic factors in human breast carcinoma [J]. Med Sci Monit, 2006, 12(11):CR457-461.

　　[5]刘灿均，陆艺，钱海鑫. 低分化胃腺癌种植瘤Fas表达及细胞凋亡的实验研究 [J]. 苏州大学学报：医学版, 2003, 23(4):402-405.

　　[6]ROJEWSKI MT, KORPER S, THIEL E, et al. Arsenic trioxide-induced apoptosis is independent of CD95 in lymphatic cell lines [J]. Oncol Rep, 2004, 11(2):509-513.

　　[7]ZHU J, OKUMURA H, OHTAKE S, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis in leukemia/lymphoma cell lines via the CD95/CD95L system [J]. Oncol Rep, 2003, 10(3):705-709.

　　[8]邬万新，江悦琴，姜叙诚. Fas/Fas-ligand介导的凋亡与胃癌免疫逃逸的关系 [J]. 中华普通外科杂志, 2003, 18(1):52-53.

　　[9]KITAMURA K, MINAMI Y, YAMAMOTO K, et al. Involvement of CD95-independent caspase 8 activation in arsenic trioxide-induced apoptosis [J]. Leukemia, 2000, 14(10):1743-1750.