大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响

　　【摘要】 目的 研究中药大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响。方法 体外培养肝细胞株HL7702，随机分为对照组和大黄素处理组。对照组未予大黄素处理，大黄素处理组按100、10、1μmol/L分为高、中、低3个浓度组，建立模拟冷缺血再灌注模型，流式细胞技术检测各组细胞内钙离子浓度及细胞凋亡水平，分别检测各组细胞培养上清液乳酸脱氢酶水平。结果 冷缺血8h再灌注6h后，高、中、低浓度大黄素处理组钙离子荧光强度分别为(24.12±0.51)、(26.35±1.34)、(39.12±1.94)，均显著低于对照组的105.29±1.01(P<0.01)。高、中、低浓度大黄素处理组细胞凋亡率分别为(5.46±0.41)%、(10.64±0.64)%、(11.90±0.50)%，均显著低于对照组的(25.40±1.41)%(P<0.01)。高、中浓度大黄素处理组上清液LDH含量分别为(179.67±18.57)u/L、(198.83±14.22)u/L，显著低于对照组的(351.33±34.16)u/L(P<0.01)。结论 大黄素可降低模拟冷缺血再灌注后的肝细胞内钙离子浓度，抑制细胞凋亡，减轻肝细胞损伤。

　　【关键词】 大黄素;肝细胞;冷缺血再灌注;细胞内钙离子浓度;凋亡

　　Effect of Emodin on intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) andapoptosis of hepatic cells after simulated cold ischemiareperfusion

　　QI Xiang, L Yi, SHEN Naiying, LIU Chang, LIU Xuemin, WANG Bo

　　Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of Emodin on intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) and apoptosis of hepatic cells after simulated cold ischemiareperfusion. Methods Glucoseoxygen deprivation, low temperature, subsequent reoxygenation and rewarming were used to induce ischemiareperfusion injury model in cultured hepatic cells which were divided into 4 groups: control group and Emodintreated group(100, 10 and 1μmol/L groups). The intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM) respectively; the content of lactate dehydrogenase (LDH) in supernatant was tested. Results Intracellular calcium fluorescence intensity in Emodintreated groups of high, medium and low density was 24.12±0.51, 26.35±1.34 and 39.12±1.94, respectively, which were significantly lower than 105.29±1.01 in control group(P<0.01). Apoptosis rate in Emodintreated groups of high, medium and low density was 0.0546±0.0041, 0.1064±0.0064 and 0.1190±0.0050, respectively, which were significantly lower than 0.2540±0.0141 in control group(P<0.01). LDH was (198.83±14.22)u/L and (179.67±18.57)u/L in Emodintreated groups of medium and high density respectively, which were significantly lower than (351.33±34.16)u/L in control group(P<0.01). Conclusion Emodin could reduce [Ca2+]i and inhibit apoptosis of hepatic cells after simulated cold ischemiareperfusion, thus protecting hepatic cells effectively.

　　KEY WORDS: Emodin; hepatic cell; ischemiareperfusion injury; intracellular free calcium concentration; apoptosis

　　大黄素[12]化学结构为1，3，8羟基6甲基蒽醌，具有抗炎、抗肿瘤、保护肝肾等多种生物学作用。有文献报道[34]，大黄素可对细胞内钙离子浓度及细胞凋亡产生影响。钙超载及凋亡均为缺血再灌注损伤机制之一。本课题组前期研究发现[5]，大黄素对肝细胞体外模拟冷缺血再灌注损伤具有保护作用。该保护作用是否与抑制肝细胞内钙超载及凋亡有关?大黄素对冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及凋亡的影响未见相关报道。本研究拟通过观察大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及凋亡的影响，初步探讨其对冷缺血再灌注损伤可能的保护机制，为其在临床肝移植中的应用提供一定的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　肝细胞株HL7702由中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供;RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供;混合气体95% N24% CO21% O2由西安交通大学医学院后勤中心提供;大黄素、Annexinⅴ凋亡试剂盒为美国SIGMA公司产品。AO/EB凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。Fluo3/AM钙离子荧光探针为美国Biotium公司产品;LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。流式细胞仪型号FACSCabuliburTM USA，Olympus荧光显微镜型号BX51TR32FB3E01 Japan。

　　1.2 冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组

　　模拟冷缺血再灌注模型参照文献[6]的方法并加以改进：①肝细胞HL7702体外培养至对数生长期，等量均匀接种于6孔板或25mL培养瓶中，给予大黄素干预，按100、10、1μmol/L分为高、中、低浓度组和对照组(未予大黄素干预)，培养24h准备实验;②模拟缺血：将培养液吸弃，等体积加入模拟缺血溶液(NaCl 98.5mmol/L、KCl 10mmol/L、NaH2PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 6.0mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、乳酸钠40mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 6.8，4℃)，并给予大黄素干预。再将培养容器放入缺氧培养装置中，充入混合气体(95% N24% CO21% O2)，待氧分压≤1%时，同时关闭进气口与出气口，放入4℃冰箱保存8h;③模拟再灌注：取出培养容器，吸弃模拟缺血溶液，等体积加入模拟再灌注液(NaCl 129.5mmol/L、KCl 5.0mmol/L、NaH2 PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 20mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、葡萄糖55mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 7.4，37℃)，并给予大黄素干预，放入50mL/L CO2孵箱中37℃培养6h。

　　1.3 细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液乳酸脱氢酶的检测

　　Fluo3/AM钙离子荧光探针负载细胞悬液，终浓度10μmol/L，37℃避光孵育30min，PBS洗涤两遍重悬，流式细胞仪检测分析，平均荧光强度代表细胞内钙离子浓度。Annexin VPI双染法检测细胞凋亡率(apoptosis rate)及正常细胞比例(normal cell rate)。AO/EB染色法荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，严格按照试剂盒说明书操作，绿色荧光代表正常细胞，橘红色荧光代表凋亡细胞。上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量的检测严格按照试剂盒说明书操作。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据用±s表示。统计方法采用单因素方差分析，多重比较用LSDt检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 冷缺血再灌注后细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液LDH的含量

　　流式细胞技术检测结果中平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)代表细胞内钙离子浓度，模拟冷缺血再灌注后，各浓度大黄素处理组细胞内钙离子浓度均显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。并且随大黄素浓度增加，钙离子浓度有降低趋势，各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。各浓度大黄素处理组细胞凋亡率显著低于对照组，正常细胞比例显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01);低浓度组与中浓度组之间差异不具有统计学意义(P>0.05)，但高浓度组与中、低浓度组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。中、高浓度大黄素处理组培养上清液中LDH水平显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01，表1、图1)。表1 冷缺血再灌注后细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液中LDH含量的测定(略)

　　2.2 AO/EB染色在荧光显微镜下的观察结果

　　AO/EB染色荧光显微镜下观察，高浓度大黄素处理组凋亡细胞较对照组明显减少(图2)。

　　3 讨 论

　　临床肝移植过程中，不可避免的存在肝脏冷缺血再灌注损伤。本研究所采用的体外模拟冷缺血再灌注模型，参考文献[6]并加以改进，用低钠、高钾、代酸、缺糖、无血清溶液模拟缺血时肝细胞微环境，并充入混合气体(95% N24% CO21% O2)模拟缺氧过程，4℃冷保存模拟冷缺血过程;冷缺血8h后用正常电解质、正常pH值、富糖、富血清溶液模拟再灌注时肝细胞微环境，并复温复氧模拟再灌注过程。此模型充分考虑了冷缺血再灌注过程中温度、供氧、营养、电解质、酸碱度的变化，相对全面的模拟了该病理生理过程。

　　钙超载是缺血再灌注损伤的机制之一。在缺血阶段，能量供应不足以维持Na+泵功能，导致Na+内流，同时缺氧造成细胞内酸中毒，胞内H+浓度增高，再灌注时则发生Na+H+交换，使细胞内Na+浓度增高，继而通过Na+Ca2+交换，胞外Ca2+大量内流，形成钙超载。钙超载可激活各种Ca2+依赖性通道[79]，损伤线粒体功能，使产能减少，耗能增加，并激活Ca2+依赖性的酶，使生物膜进一步受损。本研究中确实发现随细胞内钙离子浓度增高，肝细胞损伤加重的现象，体现在LDH水平逐渐增高。随着大黄素浓度增高，肝细胞内钙离子浓度和上清液LDH水平有降低的趋势。这可能是大黄素对肝细胞冷缺血再灌注损伤的保护机制之一。

　　本研究首次探讨了大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度的影响，结果表明各浓度大黄素处理组均能抑制肝细胞冷缺血再灌注后钙离子内流，降低细胞内钙离子浓度，有效减轻了细胞内钙超载，其作用具有浓度依赖性。这与其对心肌细胞的影响不同。刘影等[34]认为大黄素对心肌细胞内钙离子浓度具有双向调节作用，高浓度大黄素处理组抑制心肌细胞钙离子内流，中浓度组无作用，低浓度组促进钙离子内流。这说明不同浓度大黄素对细胞内钙离子水平的影响可能与细胞种类有关。

　　近来证实细胞调亡为缺血再灌注损伤的重要机制之一[911]。本研究首次证实大黄素能够抑制模拟冷缺血再灌注后肝细胞凋亡，增加正常肝细胞比例，其作用有一定的浓度依赖性，这可能是其对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护机制之一。WU等[12]认为大黄素可以降低细胞内[Ca2+]i及炎症因子生成，抑制正常细胞凋亡;SHIEH等[13]认为大黄素可体外诱导多种肝癌细胞发生凋亡;这种双重作用可能与大黄素对一些致癌基因信号转导的特异性靶向作用有关，具体机制目前仍不清楚。但这种双重作用在肝癌肝移植的治疗中意义重大，既可减轻肝脏冷缺血再灌注损伤，又降低了肿瘤复发率。

　　综上所述，本研究从细胞水平初步探讨了大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及凋亡的影响，提示大黄素有可能通过抑制细胞内钙超载及细胞凋亡，从而减轻肝细胞冷缺血再灌注损伤，为其在临床肝移植中的应用提供一定的实验依据。

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