乙型肝炎病毒基因型检测及其与肝功能的关系

　　【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒基因型与肝功能的关系。方法 采用微板核酸分子杂交ELISA法检测93例不同临床类型的乙型肝炎患者的基因型并同时测定肝功能。结果 93例不同临床类型乙型病毒性肝炎患者中，B型24例(25.81%)，C型59例(63.44%)，D型5例(5.38%)，混合型5例(B/D 3例，C/D 2例，占5.38%)。93例不同临床类型的乙型肝炎患者中，以C基因型为主，其次为B基因型，部分以D型和混合型存在，无A、E、F型。按照慢性乙型肝炎、亚急性重型肝炎、肝硬化的顺序，C基因型的检出率逐渐增多，B基因型的检出率逐渐减少。肝癌患者C基因型的检出率没有依次增高。C基因型各型乙型肝炎患者的ALT、AST、TBIL均高于B型，ALB低于B型，但差别无统计学意义。结论 西安地区病毒性肝炎以C基因型为主，部分以B、D及混合型存在，未发现A、E、F型。除肝癌外，C型的检出率随临床类型的加重而增多。

　　【关键词】 乙型肝炎病毒;基因型;微板核酸分子杂交;肝功能

　　Detection of hepatitis B virus genotype and the relationship between　hepatitis B virus genotype and the function of liver

　　ZHU Fengqun, HUO Kang, LI Chunji, DI Pengchao

　　Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV) genotype and liver function. Methods The method of microboard nucleate molecular hybridization was employed to detect the genotype in 93 HBV patients of different clinical types and the function of liver. Results Among the 93 HBV patients of different clinical types, there were 24 cases of genotype B (25.81%), 59 cases of genotype C (63.44%), 5 cases of genotype D (5.38%), and 5 cases of mixed type (3 cases of B/D, 2 cases of C/D, 5.38%). Therefore, genotype C took up the largest proportion, followed by genotype B, and then D and mixed genotypes, but there was no genotype A, E or F. The detection rate of genotype C increased according to the sequence of chronic hepatitis B, subacute severe hepatitis and hepatocirrhosis while the detection rate of genotype B decreased gradually. However, the detection rate of genotype C in hepatocellar carcinoma did not rise correspondingly. The levels of ALT, AST and TBIL of genotype C were higher than those of genotype B, but the level of ALB in genotype C was lower than that of genotype B. None of the differences had significance. Conclusion Most of HBV genotypes in Xian were C, some of them were B, D and mixed genotypes, but no genotype A, E or F was detected. Except hepatocellar carcinoma, the detection rate of genotype C rose according to the severity of clinical type.

　　KEY WORDS: hepatitis B virus; genotype; microboard nucleate molecular hybridization; function of liver

　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的临床过程多种多样,除了与宿主的免疫状况、感染方式等有关,与感染病毒株的基因型种类也关系密切。不同基因型的HBV代表着在生物学特性方面的差异，HBV基因分型有助于对病情、治疗及预后的评价。目前各地区的检测方法不同，研究的结论不尽相同。我们采用微板核酸杂交ELISA技术进行基因分型，并同时测定肝功能，评价其对肝功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料

　　93例患者均来自西安交通大学医学院第一附属医院传染科2005年6月～2005年11月住院患者。诊断标准符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》，所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒混和感染及其他原因引起的肝炎，既往未曾进行抗病毒治疗。其中亚急性重型肝炎4例，慢性乙型肝炎中度25例，重度24例，乙肝肝硬化28例，肝癌12例，男70例，女23例，年龄19～68岁，平均年龄42.40岁。所有血液标本均新鲜分离血清，-25℃保存，待整批检测。

　　1.2 试剂和仪器

　　HBV基因分型PCR微板核酸分子杂交ELISA试剂盒由第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心提供。DG3022A型酶标仪为国营华东电子管厂生产。9700型基因扩增仪为美国PE公司生产。

　　1.3 检测方法

　　1.3.1 采用微板核酸杂交ELISA技术进行基因分型

　　①引物及探针：根据HBV 6个基因型的特异基因序列，选择前C区的不同序列作为PCR引物和核酸杂交探针，6个基因型通用的序列作为PCR的引物和通用包被探针，而同一部位的不同序列作为各型的显色探针，并采用Primer软件设计引物和探针。显色探针5标记Biotin由上海生物工程有限公司合成。序列为：引物W1：CCCTTCTTCGTCTCGCGGTTCC(nt 1490～1510);引物W2：ACCAATTTATGCCTACAGCCTC(nt 1798～1777)。

　　②HBVDNA的提取及扩增：取处理液100μL于0.5mL离心管内，加待测血清100μL，混匀，100℃煮沸15min，12000r/min离心5min，取上清液作为扩增模板。取上清液12μL于反应液管内，弹匀，10000r/min离心10s，上机循环，预变性94℃ 2min，循环条件：94℃ 50s、55℃ 50s、72℃ 65s，共循环38次，最后72℃延伸3min。

　　③微板杂交及酶联显色：将扩增产物98℃变性10min，迅速冰浴10min。各取杂交液90μL，各型显色探针25μL，已变性产物20μL，分别加入反应孔内，轻轻混匀，50℃水浴60min。轻轻弃去上清液后加入200μL杂交洗液，50℃洗涤3～5min，共3次。每孔中加入100μL酶抗体，37℃孵育30min后，轻轻弃去上清液，加入200μL酶洗液，置37℃ 3～5min，再重复洗2次。每孔加显色剂A、B各1滴，避光，置37℃ 10min后加入终止液1滴，在450nm波长处检测A值。

　　④结果判断：P/N≥3.0为HBVDNA阳性，P/N<3.0为阴性(阴性对照A值小于0.05，按0.05计算：P/N比值=标本A值/阴性对照A值)。

　　1.3.2 肝功能的检测

　　采用全自动生化分析仪检测白蛋白、球蛋白、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)等。

　　1.4 统计学方法

　　数据处理使用SPSS13.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同临床类型乙肝患者HBV基因型分布特点

　　结果见表1。93例不同临床类型乙型病毒性肝炎患者中，B型24例(25.81%)，C型59例(63.44%)，D型5例(5.38%)，混合型5例(B/D 3例，C/D 2例，占5.38%)。结果显示，93例乙型肝炎病毒患者以C型为主，其次为B型，部分以D型和混合型存在，无A、E、F型。表1 不同临床类型乙肝患者HBV基因型分布的特点(略)

　　2.2 不同临床类型乙肝患者HBV基因型与肝功能的关系

　　C型乙肝患者的ALT、AST、TBIL、TP均高于B型,而ALB低于B型,但差别无统计学意义(表2)，D型共5例，混合型共5例，因例数较少未统计在内。表2 不同临床类型乙肝患者HBV基因型与肝功能的关系(略)

　　3 讨 论

　　研究表明，HBV的基因型是决定慢性HBV感染者临床预后的一个重要因素。我国HBV基因分型以B、C型最常见，其中北方以B型多见，南方以C型为主，但各地HBV流行的优势基因型也不尽相同。有些省的优势基因型为B型[23]，夏国良等[4]对我国8个城市乙肝患者用测序法进行基因分型，发现长春、兰州、宁夏、陕西等地的优势基因型主要为C型。我们采用PCR微板核酸杂交ELISA技术对西安地区93例不同临床类型的乙肝患者进行了HBV基因分型，发现以C型为主(63.44%)，部分为B型(25.81%)，亦有D型(5%)和混合型(5%)，未发现A、E和F型。

　　HBV基因型不同与感染HBV后的临床类型密切相关。DING等[5]的研究认为，按照慢性携带者(ASC)→慢性肝炎(CH)→肝纤维化(LC)→肝癌(HCC)的顺序。C型逐渐增多，而B型逐渐减少。KAO等[6]对台湾HBV基因型分析也支持上述观点。本研究结果显示，按照亚急性重型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化的顺序，C基因型的检出率逐渐增多，B型的检出率逐渐减少，而肝癌患者的C型检出率没有依次增高。这与以上研究结果略不同，可能与肝癌样本量较少有关。观察B、C基因型的乙肝患者与肝功能的关系，发现C型乙肝患者的ALT、AST、TBIL、TP均高于B型,而ALB低于B型,但差别无统计学意义。ALT及AST较高，提示肝脏炎症活动程度较高，与较严重的肝病有关。ALB低提示肝脏的合成ALB的功能低下。与B基因型相比,C基因型的肝功能异常更为常见。 陈公英等[7]分析了浙江省乙型肝炎病毒B、C基因型感染者临床和肝组织病理情况，表明C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重，其结果和本研究的结果一致。本研究根据不同基因型乙肝的预后判断及采取不同的治疗办法可能对临床具有一定的指导意义。

　　【参考文献】

　　[1]ARAUZRUIZ P, NORDER H, ROBERTSON BH, et al. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America [J]. J Gen Virol, 2002, 83(8):20592073.

　　[2]邹祺，张善锋，毛红丽. 河南省2型肝炎病毒基因型的分布 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2006, 41(5):941942.

　　[3]刘映霞，胡国令，谭德明. 湖南省乙肝病毒基因型分布及临床意义 [J]. 湖南医科大学学报, 2002, 27(1):2931.

　　[4]夏国良，贾志远，刘洪斌，等. 乙肝病毒基因型和血清亚型在我国部分地区的分布及其特点 [J]. 中华流行病学杂志, 2001, 22(5):348351.

　　[5]DING X, MIZOKAMI M, YAO G, et al. Hepatitis B virus genotype distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai [J]. China Intervirology, 2001, 44(1):4347.

　　[6]KAO JH, CHEN PJ, LAI MY, et al. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B [J]. Gastroenterology, 2000, 118(3):554559.

　　[7]陈公英，邵俊斌，徐岱，等. 浙江省乙型肝炎病毒B，C基因型感染者临床和肝组织病理的比较 [J]. 中华传染病杂志, 2006, 24:113115.