硝酸亚铈对培养的正常细胞的毒性作用及对肿瘤细胞的抑瘤效应

　　【摘要】 目的 探讨硝酸亚铈体外毒性、抑瘤率及其对细胞周期的影响。方法 采用MTT法检测硝酸亚铈对正常细胞系FL、L929体外毒性，对肿瘤细胞系Hela、SGC7901、B16、Lewis、K562、H22的体外抑瘤效应。采用流式细胞仪检测硝酸亚铈对SGC7901的细胞周期影响。结果 硝酸亚铈在0.64mmol/L以下时对FL、L929无任何毒副作用;硝酸亚铈在0.64mmol/L以上时对以上6种肿瘤细胞均有明显的抑制增殖作用，在0.08mmol/L时对HeLa、SGC7901、B16及K562肿瘤细胞表现出显著的抑制增殖作用，在0.01、0.04mmol/L时，对H22亦有显著抑制作用;0.08mmol/L硝酸亚铈作用48h，能显著延长SGC7901细胞株的G0/G1期，缩短S期;1.28mmol/L硝酸亚铈作用48h，除了能够显著延长SGC7901细胞株的G0/G1期，显著缩短S期以外，还能延长G2/M期。结论 硝酸亚铈对正常细胞具有低毒性和高度选择性，在体外通过影响细胞周期来抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖。

　　【关键词】 硝酸亚铈;细胞周期;细胞培养

　　Effect of cytotoxicity on normal cells and antitumor activityon tumor cells of cerium nitrate in vitro

　　ZHANG Guiying, ZHAO Haijun, XIN Zhenjiang, QU Jingle, WANG Baogui, WANG Hao4

　　1. Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health,Jilin University, Changchun 130021; 2. Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053;3. Jilin Prison Administrative Bureau Hospital, Changchun 130021;

　　4. The Agricultural Department of Jilin University, Changchun 130021, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the cytotoxicity on normal cell lines of cerium nitrate, the inhibitory effect on tumor cell lines and the effect on cell cycle in vitro. Methods The cytotoxicity of cerium nitrate on FL, L929 and inhibition rate on Hela, SGC7901, B16, Lewis, K562, and H22 in vitro were detected with the method of MTT. The effect of cerium nitrate on cell cycle of SGC7901 was studied by onefluorescence dying method on flow cytometer. Results Cerium nitrate did not show the toxic activities on FL and L929 cell lines when the dose of cerium nitrate was below 0.64mmol/L. When the dose of cerium nitrate was above 0.64mmol/L, it could noticeably inhibit the growth and proliferation of tumor cells (Hela, SGC7901, B16, Lewis, K562, H22) in vitro. 0.08mmol/L cerium nitrate inhibited the growth and proliferation of tumer cells including HeLa, SGC7901, B16 and K562; cerium nitrate had a noticeably inhibitory effect on the growth and proliferation of H22 cell lines in vitro on 0.04mmol/L and 0.01mmol/L. Cerium nitrate affected tumor cell lines for 48h, cerium nitrate could delay G0/G1 and shortened S of cell cycle at the dosage of 0.08mmol/L; at the same time cerium nitrate could delay G0/G1, G2+M and shorten S of cell cycle at the dosage of 1.28mmol/L. Conclusion Cerium nitrate has the property of low toxicity and high selectivity on normal cells, but it can inhibit growth and proliferation of many kinds of tumor cell lines by adjusting cell cycle.

　　KEY WORDS: cerium nitrate; cell cycle; cellular culture

　　铈元素Cerium在1803年首次被瑞典化学家伯采利乌斯(J.J.Berzelius)和他的老师黑新格尔(W.Hisingerr)在分析瑞典产的Tungsten矿(“重石”之意)时发现并命名[1]。尽管铈元素发现很早，真正应用于工农业生产却是在80多年以后，直到20世纪才开始应用于医学领域。自上世纪90年代起，我国学者纪云晶等人发表论文提出稀土元素有潜在的抗肿瘤作用[2];之后又有一系列有关铈与肿瘤发病的流行病关系的报道[3]，使得稀土元素在抗肿瘤方面的开发与利用受到重视。本研究将对稀土元素铈体外毒性、抗肿瘤作用及其机理进行探索，为稀土元素铈的开发利用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株

　　人羊膜细胞(FL)、小鼠纤维母细胞(L929)、人宫颈癌细胞(Hela)、人胃癌细胞(SGC7901)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人肺癌细胞(Lewise)、人髓样白血病细胞(K562)、小鼠肝癌腹水型细胞(H22)均由本教研室提供。

　　1.2 主要试剂

　　硝酸亚铈(天津市德兰精细化工厂);IMDM培养基(GIBCO公司);小牛血清(大连生物试剂厂);胰蛋白酶(DIFFICO公司);MTT粉(AMRESCO公司);DMSO(北京益利精细化学品有限公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 硝酸亚铈对正常细胞系FL、L929细胞的体外毒性效应

　　将FL、L929细胞制成悬液，加入含小牛血清(FCS)40mL/L的IMDM培养液，并调整细胞浓度至1×105/mL，取96孔平底培养板，各孔加入100μL细胞悬液;设10个给药剂量，分别为阴性对照组、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mmol/L，每个剂量设3个复孔，由低到高，每孔加入硝酸亚铈溶液100μL。在37℃、50mL/L CO2条件下孵育44h，各孔加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，继续孵育4h终止培养。弃上清液，每孔加入100μL DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值，计算体外细胞毒百分率。

　　体外细胞毒百分率=(对照孔A值-药物孔A值)对照孔A值×100%

　　1.3.2 硝酸亚铈对HeLa细胞、SGC7901细胞、B16细胞、Lewis细胞、K562细胞、H22细胞的体外抑瘤效应

　　细胞培养和检测方法与1.3.1所述相同，测定各孔A值，计算体外抑瘤率。

　　体外抑瘤率=(对照孔A值-药物孔A值)对照孔A值×100%

　　1.3.3 硝酸亚铈对SGC7901细胞周期的影响

　　SGC7901细胞常规培养。将处于对数生长的SGC7901细胞以5×105/mL的密度接种于18个培养瓶中，培养24h。分别加入0.00、0.08、1.28mol/L的硝酸亚铈，继续培养48h。用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用PBS液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5min，调细胞浓度为1×106/mL。取1mL细胞悬液，加入等体积RNA酶，37℃消化30min，再加入等体积PI染液，4℃染色30min，进行流式细胞仪测样[4]。

　　1.3.4 统计学处理

　　采用SPSS12.0统计软件，满足方差齐性条件时，多组比较采用ANOVA法分析，多重两两比较采用LSD法分析;当各组总体方差不满足方差齐性条件时，多组比较采用Welch法分析，多重两两比较采用DunnettT3法分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTT法检测硝酸亚铈对FL、L929细胞的体外毒性效应结果

　　硝酸亚铈在0.64mmol/L剂量以下时对FL无毒副作用，并有促进细胞生长的作用，在0.64～2.56mmol/L剂量范围内随剂量增大毒性也增强。1.28、2.56mmol/L与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05);在0.16mmol/L剂量以下时对L929无毒副作用，并有促进细胞生长的作用，在0.64～2.56mmol/L剂量范围内随剂量增大毒性也增强。2.56mmol/L与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05，表1)。表1 MTT法检测硝酸亚铈对FL、L929细胞系的体外毒性(略)

　　2.2 MTT法检测硝酸亚铈对HeLa、SGC7901、B16、Lewis、K562、H22细胞体外抑瘤率的比较

　　①硝酸亚铈9个剂量组对B16、K562和H22细胞的抑制率与阴性对照组比较均具有极显著性差异(P<0.01)。②硝酸亚铈剂量高于0.64mmol/L时对HeLa、SGC7901和Lewis细胞的抑制率与阴性对照组比较均有极显著性差异(P<0.01);而在0.64mmol/L以下各剂量组也对上述3种肿瘤细胞存在不同程度的抑制作用，尤其0.08mmol/L剂量组的抑制率与阴性对照组比较均有极显著性差异(P<0.01，表2)。表2 MTT法检测硝酸亚铈对HeLa、SGC7901、B16、Lewis、K562、H22细胞增殖的抑制作用比较(略)

　　2.3 流式细胞仪检测硝酸亚铈对SGC7901细胞周期的影响

　　SGC7901细胞加药培养48h，0.08mmol/L剂量组与阴性对照组比较，G0/G1期、S期均具有极显著性差异(P<0.01);1.28mmol/L剂量组与阴性对照组比较，G0/G1期、S期、G2+M期均具有极显著性差异(P<0.01，表3)。表3 流式细胞仪检测硝酸亚铈对SGC7901细胞周期的影响(略)

　　3 讨论

　　近年来，高效低毒的抗癌药物成为新的研究热点。本研究结果表明，硝酸亚铈在0.64mmol/L以下对正常的细胞FL、L929无明显毒副作用，甚至有促进细胞生长的作用。这与国内有关报道一致[5]。

　　体外抑瘤实验证实，受试药物剂量在0.64mmol/L以上时，对HeLa、SMMC7221、SGC7901、B16、Lewis、K562以及H22均有显著的抑制肿瘤增殖的作用，且随着硝酸亚铈剂量的增高抑瘤率也不断上升。尤其值得注意的是0.08mmol/L的硝酸亚铈对B16、SGC7901、HeLa和K562肿瘤细胞表现出显著的抑制细胞增殖作用;0.01和0.04mmol/L的硝酸亚铈对H22也表现出显著的抑制细胞增殖作用。

　　因此，硝酸亚铈一方面特异地抑制肿瘤细胞增殖，即硝酸亚铈对肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用，对正常细胞的增殖无明显的抑制作用[6];另一方面硝酸亚铈在微量时的抑瘤作用也是特异的，即当硝酸亚铈的剂量在0.1mmol/L以下时，受试药物对肿瘤有一定的选择性，表现为对某几种肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用，并且表现为“双峰”抑制。在不同剂量下，硝酸亚铈对肿瘤细胞增殖抑制作用不同，这可能与高剂量Ce3+作用于细胞外[5]，而低剂量Ce3+作用于细胞内，影响不同的细胞器功能有关。

　　本实验结果表明，0.08mmol/L硝酸亚铈作用48h，能显著延长SGC7901细胞株的G0/G1期，显著缩短S期;1.28mmol/L硝酸亚铈作用48h，除了能够显著延长SGC7901细胞株的G0/G1期，显著缩短S期以外，还能延长G2/M期。说明硝酸亚铈对SGC7901肿瘤细胞的抑制作用在于抑制DNA合成，阻止细胞增殖周期的正常运行，具体机制可能与细胞周期调控因子CDKs、cyclins、CKIs等的表达有关[7]。

　　【参考文献】

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　　[7]姜宏华，张一楚. 细胞周期调节因子与肿瘤 [J]. 国外医学·外科学分册, 2003, 30(4):195198.