自身抗体——肿瘤新的早期诊断标志物

　　作者：李官成，童永清 作者单位：(中南大学肿瘤研究所，湖南长沙 410078)

　　【摘要】 肿瘤标志物是指肿瘤细胞本身存在的或分泌的、能反映肿瘤的存在和生长的特异性物质。血清肿瘤标志物已被广泛应用于肿瘤的检测，但是这些标志物的检测是基于肿瘤抗原，在肿瘤的筛选和诊断方面存在很多的不足。本文就目前基于肿瘤患者体内针对肿瘤抗原的自身抗体作为肿瘤诊断的标志物进行综述。这种检测方法是利用肿瘤抗原来检测肿瘤自身抗体，其特异性和敏感性优于传统的检测方法，并为肿瘤的筛选和诊断提供了新的手段。

　　【关键词】 自身抗体;肿瘤标志物;早期诊断;肿瘤抗原

　　Autoantibodies: the early diagnostic biomarkers for tumorsLI Guancheng, TONG Yongqing

　　(Cancer Research Institute, Xiangya School of Medicine,

　　Central South University, Changsha 410078, China)ABSTRACT: Tumor markers refer to the specific substances that exist in tumor cells themselves or are secreted by tumor cells. They can reflect the existence and growth of the tumor. The serum tumor biomarkers have been widely applied in tumor detection, but the detection of these markers is based on the tumor antigens, and thus has many inadequacies in tumor screening and diagnosis. In this paper, we reviewed autoantibodies as tumor biomarkers against selfantigens in vivo. This method is to examine the tumor autoantibodies by using the tumor antigens, and its specificity and sensitivity are superior to the traditional examination methods. Using autoantibodies to detect tumors would provide a new method for tumor screening and diagnosis.

　　KEY WORDS: autoantibody; tumor biomarker; early diagnosis; tumor antigen

　　在过去的几十年中，已有多种肿瘤抗原被鉴定[13]，其中有些肿瘤抗原已经被用于肿瘤诊断，如前列腺特异性抗原 (prostate specific antigen, PSA) 作为前列腺癌的标志物，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA) 作为结直肠癌的标志物，CA199作为胃肠道肿瘤的标志物，以及MUC1作为胰腺癌的早期诊断标志物等。另外，发现一些常见的蛋白质、激素和酶也可以作为肿瘤标志物[45]。但这些肿瘤抗原在部分良性病变或者妊娠期也会明显增加，缺乏特异性和敏感性，还没有一个能成为真正意义上的肿瘤标志物。因此，迫切需要寻找新的肿瘤标志物，并将这些肿瘤标志物应用于临床。大量研究表明，肿瘤本身能诱导机体免疫反应，产生抗肿瘤相关抗原的自身抗体，在肿瘤抗原表达即使很低的时候也能够检测到[6]。因此，以与肿瘤抗原相关的自身抗体作为肿瘤诊断的标志物，利用肿瘤患者体内内源性的体液免疫反应来检测发生恶性转化的细胞，有可能逐渐被人们所认识和接受[78]。

　　1 肿瘤自身抗体的鉴定方法

　　近年来，随着蛋白质组学技术的发展，如质谱、蛋白质微阵列等，极大地提高了从肿瘤患者血清中发现新的自身抗体标志物的可能性。这种基于DNA和蛋白质的技术都可用来寻找和鉴定自身抗体标志物，而大量血清自身抗体的成功鉴定与高通量的筛选策略发展密不可分[910]。目前，在筛选自身抗体及肿瘤分子标志物的多种方法中，以重组cDNA表达文库血清学分析法和蛋白质组学血清学分析运用最为广泛。

　　1.1 血清学筛选cDNA表达文库技术 血清学筛选cDNA表达文库技术(serological screening of cDNA expression library, SEREX)首先由SAHIN等[11]在10年前开始用于肿瘤抗原的筛选，其基本方法是使用肿瘤组织的RNA构建一个cDNA文库，插入到λ噬菌体载体臂中，然后在大肠杆菌中表达，将重组的蛋白质转移到硝酸纤维素膜中，然后与肿瘤患者血清或者正常人血清反应，选取仅与肿瘤患者血清发生反应的克隆进行单克隆化后获取相应的插入序列，即可获得肿瘤抗原。我室舒峻等[12]通过该技术筛选发现在鼻咽癌中存在RPL31和HSBP1等肿瘤抗原。目前，通过该方法已经筛选鉴定出超过2000个具有免疫原性的肿瘤相关抗原(tumor associated antigens, TAAs)，如GLUT1、CLUAP1和肿瘤睾丸抗原SSX、CAGE等。

　　1.2 二维聚丙烯凝胶电泳 二维聚丙烯凝胶电泳(twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2DPAGE)基本操作流程是将来源于肿瘤组织或者肿瘤细胞系的多种混合蛋白质分离，再将分离的蛋白质转移到膜上，与肿瘤患者或者正常人的血清反应，仅与肿瘤患者血清发生反应的蛋白质进行质谱鉴定。MACKEIGAN等[13]利用该方法鉴定发现非小细胞肺癌中存在RS/DJ1抗原;PEREIRAFACA等[14]发现肺癌中的1433 theta肿瘤抗原;LI等[15]通过该方法从肝癌细胞系中鉴定了凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor, AIF)和磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase, TIM) 等肿瘤抗原。近年来，随着质谱技术的飞速发展，越来越多的肿瘤抗原通过2DPAGE与质谱技术联合运用得到鉴定，如抗糖蛋白CA125自身抗体，有可能作为卵巢癌的肿瘤标志物，用于监测卵巢癌的进展[16];抗TIM和超氧化物歧化酶[superoxide dismutase (Mn), MnSOD]自身抗体在肺鳞状细胞癌中表达明显升高，而在其他肿瘤组织和正常组织中低表达或不表达[17]，二者有可能作为肺鳞状细胞癌的诊断标志物。

　　1.3 蛋白质微阵列 蛋白质微阵列(protein microarray)是一种高通量筛选肿瘤自身抗体的方法，可以用肿瘤患者血清在同一蛋白芯片上同时筛选几千种蛋白质，更有利于筛选获得肿瘤自身抗体[18]。目前，已经有几种蛋白质微阵列用于高通量筛选策略，其中以近年来用于筛选前列腺癌、肺癌和乳腺癌等自身抗体的T7噬菌体展示技术应用最为广泛。

　　T7噬菌体展示技术[19]是构建肿瘤组织或者肿瘤细胞系T7噬菌体cDNA表达文库，候选的肿瘤抗原肽表达并展示在噬菌体表面，然后通过生物淘洗策略将与肿瘤患者血清发生特异性反应的重组噬菌体进行富集，最后将所获得的重组噬菌体制备蛋白质芯片。生物淘洗的过程其实就是一个对T7噬菌体cDNA文库进行免疫沉淀的过程。通过生物淘洗，获得能与肿瘤患者的血清发生反应的重组噬菌体，而去除了与正常人血清发生反应的重组噬菌体。通过该方法筛选的肿瘤自身抗体主要有抗Annexin XIA自身抗体、抗泛醌1自身抗体和抗HSP27自身抗体等。我室TONG等利用该方法发现在鼻咽癌患者血清中存在抗BMI1自身抗体[20]和抗MAGE、CD44和HSP70等自身抗体[21]。

　　其他蛋白质微阵列还有以来源于多肽文库的重组蛋白微阵列或来源于肿瘤组织或者肿瘤细胞系的天然蛋白微阵列等，如HUDSON等[22]利用重组蛋白微阵列发现了在卵巢癌中高表达的肿瘤抗原Lamin A/C、SSRP1和RALBP1，联合这些抗原检测卵巢癌患者血清中相应的自身抗体，有利于卵巢癌的诊断;QIU等[23]采用肿瘤细胞系的天然蛋白微阵列分析肺癌细胞系A549分离蛋白与肺癌患者血清之间的反应，发现从A549分离的1840个蛋白质中仅有63个蛋白质与肺癌患者血清发生反应，而不与正常人血清发生反应。此外，MADOZGúRPIDE等[24]也通过该方法发现肺癌患者血清中抗PGP9.5自身抗体明显升高，提示抗PGP9.5自身抗体有可能用于肺癌的诊断。

　　在上述蛋白质微阵列方法中，利用细菌或者病毒表达蛋白质的全长，有利于从整体水平研究候选蛋白的免疫原性。但是，蛋白质翻译后修饰如磷酸化、糖基化并不能完成，这些位点可能是蛋白质获得免疫原性的关键点。以裂解的肿瘤组织或细胞进行蛋白质微阵列分析，可能更适合筛选肿瘤自身抗体，因为在不破坏蛋白结构的前提下，使蛋白质表面的表位更容易完全暴露。

　　2 自身抗体有可能作为肿瘤发生的标志物

　　ADMON和SHOSHAN[25]提出，肿瘤患者体内产生的自身抗体在某些环境下不恰当地过度刺激生长缓慢或者静止状态的细胞，引起细胞无限增殖。比如这些自身抗体直接作用于细胞表面的受体，活化刺激生长的信号传导通路，这些异常活化的信号通路有可能导致细胞无限制的扩增，甚至导致肿瘤的发生。这些导致肿瘤发生的异常自身抗体有可能出现在肿瘤发生早期的某个阶段，在上调促肿瘤受体的表达、增加肿瘤的恶性度和导致肿瘤获得潜在的转移能力中起到关键性的作用，因而免疫反应中产生的自身抗体有可能作为肿瘤发生标志物[6]。

　　某些自身免疫系统疾病患者体内的自身抗原虽然不是细胞表型的决定性因素，但是在决定细胞表型等方面具有重要的生物学功能，因而其自身抗体具有重要的生物学意义。如系统性红斑狼疮中的Sm抗原[26]，是一种内源性的小细胞核蛋白微粒(small nuclear ribonucleo protein particles, snRNPs)，抗Sm抗体结合到表达snRNPs的细胞表面，随后进入细胞内，与细胞内snRNPs相互作用，从而影响细胞的增殖和(或)功能。硬皮病患者体内的Scl70，是分子质量为100ku的DNA拓扑异构酶Ⅰ的天然降解产物，抗Scl70的自身抗体通过影响细胞DNA的合成而影响细胞的增殖和(或)功能[27]。多发性皮肌炎患者体内的氨酰tRNA连接酶自身抗原，与一系列的蛋白质合成相关，抗氨酰tRNA连接酶的自身抗体通过调节氨酰tRNA酶的合成影响细胞蛋白质的合成[28]。

　　许多在细胞生物合成过程中具有重要作用的肿瘤自身抗原也可以通过肿瘤患者的自身抗体得到鉴定。如肝癌肿瘤抗原甲胎蛋白(ɑfetoprotein, AFP)，AFP通过影响细胞内cAMP和Ca2+浓度以及蛋白激酶A活性，促进一些原癌基因的表达，从而实现促进细胞增殖的作用[29]。还有广泛存在于多种肿瘤患者体内的p53自身抗原[30]，该抗原丧失了正常p53蛋白的功能，不能引起细胞周期阻滞，导致DNA的不完全修复，出现遗传性不稳定细胞。因此，检测这些针对参与细胞生物学功能相关的肿瘤抗原的自身抗体，可以及时地发现肿瘤。

　　3 肿瘤自身抗体作为肿瘤标志物的优点

　　大量研究表明，血清中的肿瘤标志物能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤患者血清中，既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此，既可以利用抗体检测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多[31]。以肿瘤自身抗体作为肿瘤标志物的主要优点有[21,3234]：①显著提高了检测肿瘤的特异性和敏感性，大部分肿瘤自身抗体的受试者工作特征(ROC)曲线分析中ROC曲线下面积达0.8以上，如我们筛选的抗鼻咽癌的自身抗体MAGE的ROC曲线下面积为0.8922[21];②操作简便，重复性好，检测速度快，通过常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)或酶联免疫分析(EIA)就可以检测;③通过血清中自身抗体的水平变化可以对肿瘤的不同阶段进行监测;④可以对肿瘤进行早期诊断，有利于肿瘤的早期治疗，提高肿瘤患者的预后;⑤和传统的检测方法相比，其假阳性非常低。

　　4 展望

　　由于机体的免疫监视作用，在肿瘤患者体内存在识别TAAs的自身抗体，这种自身抗体有可能在肿瘤的早期就存在[3536]。随着噬菌体展示技术、蛋白质微阵列等新的有效的高通量筛选技术的发展，越来越多的肿瘤患者体内针对TAAs的血清自身抗体被发现，这些自身抗体有可能用于肿瘤的诊断。但理想的肿瘤筛查方法必须操作简单，与传统的肿瘤标志物相比较，应该具有更好的诊断价值和能在肿瘤浸润的早期就被检测等[37]。目前，肿瘤自身抗体真正用于临床肿瘤的诊断还存在很多的困难。但是，鉴定针对TAAs的特异性自身抗体，然后检测肿瘤患者血清中的肿瘤自身抗体，而不是检测肿瘤抗原，将为肿瘤的诊断提供了一个新的有效的方法。

　　【参考文献】

　　[1]MARKOWSKA J. Tumor markers in cervical cancer [J]. Ginekol Pol, 2007, 78(9):715718.

　　[2]PAREKH DJ, ANKERST DP, TROYER D, et al. Biomarkers for prostate cancer detection [J]. J Urol, 2007, 178(6):22522259.

　　[3]MALYANKAR UM. Tumorassociated antigens and biomarkers in cancer and immune therapy [J]. Int Rev Immunol, 2007, 26(34):223247.

　　[4]DOYLE DM, MILLER KD. Development of new targeted therapies for breast cancer [J]. Breast Cancer, 2008, 15(1):4956.

　　[5]NESTEROVA MV, JOHNSON N, CHEADLE C, et al. Autoantibody cancer biomarker: extracellular protein kinase A [J]. Cancer Res, 2006, 66(18):89718974.

　　[6]TAN EM, ZHANG J. Autoantibodies to tumorassociated antigens: reporters from the immune system [J]. Immunol Rev, 2008, 222:328340.

　　[7]YURKOVETSKY ZR, LINKOV FY, E MALEHORN D, et al. Multiple biomarker panels for early detection of ovarian cancer [J]. Future Oncol, 2006, 2(6):733741.

　　[8]FINN OJ. Immune response as a biomarker for cancer detection and a lot more [J]. N Engl J Med, 2005, 353(12):12881290.

　　[9]CAIAZZO RJ Jr, TASSINARI OW, EHRLICH JR, et al. Autoantibody microarrays for biomarker discovery [J]. Expert Rev Proteomics, 2007, 4(2):261272.

　　[10]DIAMOND SL. Methods for mapping protease specificity [J]. Curr Opin Chem Biol, 2007, 11(1):4651.

　　[11]SAHIN U, TURECI O, SCHMITT H, et al. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(25):1181011813.

　　[12]舒峻，李官成，何小鹃. 鼻咽癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选 [J]. 生物工程学报, 2004, 20(1):5458.

　　[13]MACKEIGAN JP, CLEMENTS CM, LICH JD, et al. Proteomic profiling druginduced apoptosis in nonsmall cell lung carcinoma: identification of RS/DJ1 and RhoGDIalpha [J]. Cancer Res, 2003, 63(20):69286934.

　　[14]PEREIRAFACA SR, KUICK R, PURAVS E, et al. Identification of 1433 theta as an antigen that induces a humoral response in lung cancer [J]. Cancer Res, 2007, 67(24):1200012006.

　　[15]LI L, CHEN SH, YU CH, et al. Identification of hepatocellularcarcinomaassociated antigens and autoantibodies by serological proteome analysis combined with protein microarray [J]. J Proteome Res, 2008, 7(2):611620.

　　[16]JACKSON D, CRAVEN RA, HUTSON RC, et al. Proteomic profiling identifies afamin as a potential biomarker for ovarian cancer [J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(24):73707379.

　　[17]YANG F, XIAO ZQ, ZHANG XZ, et al. Identification of tumor antigens in human lung squamous carcinoma by serological proteome analysis [J]. J Proteome Res, 2007, 6(2):751758.

　　[18]GUNAWARDANA CG, DIAMANDIS EP. High throughput proteomic strategies for identifying tumourassociated antigens [J]. Cancer Lett, 2007, 249(1):110119.

　　[19]CHEN J, XU XM, UNDERHILL CB, et al. Tachyplesin activates the classic complement pathway to kill tumor cells [J]. Cancer Res, 2005, 65(11):46144622.

　　[20]TONG YQ, LIU B, HUANG J, et al. BMI1 autoantibody in serum as a new potential biomarker of nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Biol Ther, 2008, 7(3):340344.

　　[21]TONG YQ, ZHANG ZJ, LIU B, et al. Autoantibodies as potential biomarkers for nasopharyngeal carcinoma [J] . Proteomics, 2008, 8(15):31853193.

　　[22]HUDSON ME, POZDNYAKOVA I, HAINES K, et al. Identification of differentially expressed proteins in ovarian cancer using highdensity protein microarrays [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(44):1749417499.

　　[23]QIU J, MADOZGURPIDE J, MISEK DE, et al. Development of natural protein microarrays for diagnosing cancer based on an antibody response to tumor antigens [J]. J Proteome Res, 2004, 3(2):261267.

　　[24]MADOZGúRPIDE J, KUICK R, WANG H, et al. Integral protein microarrays for the identification of lung cancer antigens in sera that induce a humoral immune response [J]. Mol Cell Proteomics, 2008, 7(2):268281.

　　[25]ADMON A, SHOSHAN SH. Antibodies as oncogenes: a hypothesis [J]. Med Hypotheses, 2006, 67(3):471473.

　　[26]KELLYSCUMPIA KM, NACIONALES DC, SCUMPIA PO, et al. In vivo adjuvant activity of the RNA component of the Sm/RNP lupus autoantigen [J]. Arthritis Rheum, 2007, 56(10):33793386.

　　[27]LIEBES L, POTMESIL M, KIM T, et al. Pharmacodynamics of topoisomerase I inhibition: Western blot determination of topoisomerase I and cleavable complex in patients with upper gastrointestinal malignancies treated with topotecan [J]. Clin Cancer Res, 1998, 4(3):545557.

　　[28]LEGAULT D, MCDERMOTT J, CROUSTSANACLIS AM, et al. Cancerassociated myositis in the presence of antiJo1 autoantibodies and the antisynthetase syndrome [J]. J Rheumatol, 2008, 35(1):169171.

　　[29]ZINKIN NT, GRALL F, BHASKAR K, et al. Serum proteomics and biomarkers in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease [J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(2):470477.

　　[30]ANDERSON KS, RAMACHANDRAN N, WONG J, et al. Application of protein microarrays for multiplexed detection of antibodies to tumor antigens in breast cancer [J]. J Proteome Res, 2008, 7(4):14901499.

　　[31]SMITH RA, COKKINIDES V, EYRE HJ. American Cancer Society guidelines for the early detection of cancer [J]. CA Cancer J Clin, 2006, 56(1):1125.

　　[32]CHAPMAN CJ, MURRAY A, MCELVEEN JE, et al. Autoantibodies in lung cancer: possibilities for early detection and subsequent cure [J]. Thorax, 2008, 63(3):228233.

　　[33]LU H, GOODELL V, DISIS ML. Humoral immunity directed against tumorassociated antigens as potential biomarkers for the early diagnosis of cancer [J]. J Proteome Res, 2008, 7(4):13881394.

　　[34]LIN HS, TALWAR HS, TARCA AL, et al. Autoantibody approach for serumbased detection of head and neck cancer [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007, 16(11):23962405.

　　[35]PREUSS KD, ZWICK C, BORMANN C, et al. Analysis of the Bcell repertoire against antigens expressed by human neoplasms [J]. Immunol Rev, 2002, 188:4350.

　　[36]童永清，黄建，周国华，等. 鼻咽癌患者血清中自身抗体的初步检测 [J]. 中南大学学报(医学版), 2008, 33(3):233237.

　　[37]EHRLICH JR, TANG L, CAIAZZO RJ JR, et al. The reverse capture autoantibody microarray: an innovative approach to profiling the autoantibody response to tissuederived native antigens [J]. Methods Mol Biol, 2008, 441:175192.(编辑 邱 芬)