三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

　　作者：阮禹松1，万明习2，李晓华3 作者单位：(1. 西安交通大学生命科学与技术学院生物信息学研究中心;2. 西安交通大学生命科学与技术学院生物医学工程系，陕西西安 710049;3. 第四军医大学西京医院消化内科，陕西西安 710032)

　　【摘要】 目的 初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF7的生长抑制作用，并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制。方法 MCF7细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养1～7d后，进行MTT实验，测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分，并应用双向电泳方法对其进行分离，以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析，找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定。结果 25μmol/L的三羟异黄酮对MCF7细胞具有明显的抑制作用，并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离，并成功鉴定出24种差异表达蛋白，其中5种下调，19种上调。结论 这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面。

　　【关键词】 乳腺癌;蛋白质组学;顺序抽提;双向电泳;基质辅助激光解吸离子化电离飞行时间质谱;三羟基异黄酮

　　Proteomic study on the inhibitory effects of genistein　on human breast cancer cellsRUAN Yusong1, WAN Mingxi2, LI Xiaohua3

　　(1. Center of Bioinformatics, School of Life Science and Technology, Xian Jiaotong University,

　　Xian 710049; 2. Department of Biomedical Engineering, School of Life Science and Technology,

　　Xian Jiaotong University, Xian 710049; 3. Department of Digestive Diseases,

　　Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xian 710032, China)ABSTRACT: Objective To investigate the inhibitory effects of low concentration of genistein on human breast cancer cell line MCF7 and explore its molecular mechanism using proteomic technologies. Methods Log phase cells were cultured in 96well plates at a density of 1×103 cells/well with 25μmol/L genistein for 1 to 7 days respectively to obtain growth curve by MTT assay. Sequential protein extraction was used and proteins were fractionated as soluble or hydrophobic fractions which were then analyzed by 2DE. Spots were detected and evaluated by 2D platinum Software 5.0 and the spots with different expression level were subjected to MS analysis. Results Genistein of 25μmol/L obviously inhibited the growth of MCF7 cells and could induce apoptosis of the cells after 4 days cultivation; 2DE patterns demonstrated a good resolution either for soluble proteins or for hydrophobic proteins. Moreover, 24 significant proteins were identified, among which 19 were upregulated and 5 were downregulated. Conclusion These proteins functions are involved in many aspects of cell physiological functions such as growth regulation, stress response, cell morphogenesis and apoptosis.

　　KEY WORDS: breast cancer; proteomics; sequential extraction; twodimensional electrophoresis(2DE); matrixassisted laser desorption/ ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS); genistein

　　目前有许多学者对三羟基异黄酮的抑癌作用进行了大量的研究，其作用机制涉及了雌激素受体调节作用、抑制类胰岛素生长因子、酪氨酸蛋白激酶以及拓扑异构酶II活性等多个方面[14]。由于三羟基异黄酮与雌二醇分子结构存在很大的相似性，以往常将其抗癌能力归结为性激素调节作用。然而大量地体外实验表明高浓度(≥50μmol/L)的三羟基异黄酮对依赖雌激素的乳腺癌细胞系和不依赖雌激素的乳腺癌细胞系都表现出生长抑制效应[5]，而且三羟基异黄酮还是表皮生长因子受体的一个强有力的抑制剂(其半抑制浓度为2.6μmol/L)。然而三羟基异黄酮并不阻碍DU145前列腺癌细胞系EGFR的磷酸化及活化[6]，这一点也在其他的癌细胞系中得到了证实。此外，极低浓度(1nmol/L～10μmol/L)的三羟基异黄酮还能刺激MCF7细胞(雌激素受体阳性)生长，但对MDAMB435乳腺癌(雌激素受体阴性)细胞系却无此效应[7]。这些研究结均果提示三羟基异黄酮的抗癌效应有其他途径的存在。

　　以往的研究方法(如免疫沉淀法)往往只考虑到一个或少数几个蛋白或mRNA的变化，不可避免地存在一定的局限性和片面性。事实上任何生理、病理变化或药物影响的结果都与蛋白质的组成和量的改变密切相关。因此，只有对蛋白质的种类和数量进行整体、全面、动态的考察(即蛋白质表达谱)，才能更准确、灵敏地反映出肿瘤的性状和生物学行为。所以，本文试图通过对三羟基异黄酮作用下的MCF7细胞蛋白质表达谱的分析，以阐明三羟基异黄酮的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 三羟基异黄酮(genistein)、曲拉酮(Triton X100)、碘乙酰胺(iodoacetamide, IAA)、胰酶(TPCKtrypsin)、尿素(urea)、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、α氰基242羟基肉桂酸(CHCA)均购自Sigma(Taufkirchen, Germany)公司;丙烯酰胺单体、甘氨酸、矿物油、IPG胶条(pH 3～10, 4～7以及6～11)、低分子量标准、IPG buffer (pH 3～10，4～7以及6～11)和Protease Inhibitor Mix均购自Amersham Pharmacia Biotech公司(Uppsala, Sweden);二甲基亚砜(DMSO)、三氟乙酸、Tris碱、乙醇、乙腈以及三丁基磷(tributyl phosphine TBP，体积分数85%)购自Fluka(Buchs, switzerland);Dulbeccos modified eagle medium (DMEM)培养液、小牛血清、牛胰岛素、磷酸盐缓冲液购自Hyclone(Utah, America)。所有溶液均用超纯水(来自MilliQ)配制。

　　1.2 主要仪器和设备 IPGphor Ⅲ等电聚焦仪(GE公司);UP 200S超声破碎仪(Dr. Hielscher GmbH);Ult rospec 2100proUV(Amersham Bioscience);Hoefor SE600垂直电泳仪(Amersham Biosciences);ScanMaker 8700扫描仪(MICROTEC);Model 250 pH计(Thermo Orion);Milli Q超纯水发生器(Millipore);VoyagerDETM MALDITOF质谱仪(Applied Biosystems);CentriVap Concentrator(Labconco公司);凝胶图像分析软件ImageMaster 5.0(Amersham Biosciences公司);超速低温离心机3K30(德国Sigma公司);CO2细胞培养箱(REVCO2 EL ITE22);倒置显微镜IX70(Olympus);BP800(BIOHIT)酶标仪。

　　1.3 方法

　　1.3.1 细胞培养 MCF7细胞购自American Type Culture Collection(ATCC)，用DMEM 37℃培养并添加1.0mmol/L丙酮酸钠，0.1mmol/L非必需氨基酸(LAspartic acid, LAsparagine, Glycine, LProline, LGlutamic acid, LSerine, LHydroxyproline)，1.5g/L碳酸钠，0.01g/L牛胰岛素，100mL/L小牛血清(FBS)，50mL/L CO2，95%湿度无菌空气。当细胞生长至对数生长期时，分别将细胞在含0mol/L和25μmol/L的大豆异黄酮培养液中培养1～7d(三羟基异黄酮用DMSO配成100mmol/L的储备液并4℃保存)。实验和对照组培养液中DMSO的最终浓度均不超过0.3mL/L。培养液每2d更换1次。用Olympus IX70倒置显微镜(带有PMC35DX镜头)记录细胞形态后，用细胞刮刀收集细胞并用4℃磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次后，600×g离心，去除上清后于-80℃储存待用。

　　1.3.2 MTT实验 MCF7细胞的生长速度评估采用前人的MTT实验方法[8]。简述如下：将对数生长期的MCF7细胞转移在96孔板中培养，每孔细胞密度为1×103，培养液体积为200μL。在细胞种入的第2天加入大豆异黄酮，最终浓度为25μmol/L。细胞分别培养1、2、3、4、5、6、7d后加入MTT溶液。4h后，小心地吸出上清。用150μL 的DMSO并混匀10min。用酶标仪BP800(BIOHIT)在490nm处进行每孔扫描，重复3次，取均值。上述实验重复3次。

　　1.3.3 蛋白质顺序抽提 蛋白质的顺序抽提基本参照文献[9]方法进行：MCF7细胞用冷的5mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0(含1mmol/L EDTA和1mmol/L PMSF)，冰浴裂解，震荡5min后，用超声破碎仪(UP 200S)超声20次，重复(避免产生气泡)。600×g离心10min以去除未破碎的细胞和细胞核。收集上清，17000×g离心后，收集上清(水溶性蛋白)，冻干，-80℃储存待用;沉淀(膜粗品)用5mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0(含1mmol/L EDTA和1mmol/L PMSF)稀释至原体积的50倍，冰浴震荡2min，17000×g离心30min，此过程再重复一次;收集沉淀，即为膜样本。

　　将水溶性蛋白组分和洗脱后的膜样品用裂解液(7mol/L urea，2mol/L thiourea，40g/L CHAPS，5mL/L Triton X100，10mL/L IPG buffer，5mmol/L TBP，10mL/L Protease Inhibitor Mix和20mmol/L Tris)溶解，4℃震荡1h后，20000×g离心1h，将上清(上清吸取时要小心避开液体表面的脂质层)转移到另一个离心管中。定量，60μg分装，保存于-80℃。

　　1.3.4 双向电泳 第一向采用13cm的线性IPG干胶条(pH 3～10，pH 4～7，pH 6～11)进行等电聚焦，控温20℃。IPG干胶条在不含样品的水化液(250μL)中泡胀过夜。之后，将含60μg蛋白质的80μL样品溶液加入到阳极端的样品杯中。滤纸垫用超纯水浸湿后在滤纸上沾干，然后置于IPG胶条的两端，上面放好电极。其等电聚焦设置如下：①500V，10min，gradient模式;②4000V，3h，gradient模式;③8000V，step and hold模式直到26kVh。当聚焦到20kVh左右，在胶条碱性端的滤纸条上加入2mol/L浓度的DTT 1.5μL。等电聚焦结束后，胶条在含40g/L的SDS平衡液中平衡10min。平衡后IPG胶条转移至11.5%，1mm厚的SDS/PAGE胶并用5g/L的低熔点琼脂糖固定。3μL SDS/PAGE分子量标准通过滤纸加载到IPG胶条的一侧。SDSPAGE胶用SE600(AmershamPharmacia, Sweden) 进行分离：10mA/gel，30min后20mA/gel 直到溴酚蓝指示线到达PAGE的底部边缘。

　　1.3.5 银染和图象分析 2DE 较采用与质谱分析相兼容的银染进行[10]。染色后，胶用ScanMaker 8700 scaner (MICROTEK)扫描(扫描后胶4℃保存于100mL/L乙酸溶液中)。图像存储为TIF格式并输入ImageMaster 2D Platinum Software 5.0(Amersham

　　Pharmacia, Sweden)软件进行分析。点检测参数设置如下：首先，将Smooth parameter调整为2.5使得所有真正的点均可被检测，然后，将minimum area设置为10 pixels 以消除面积小于该值的点。最后，根据实际情况调整saliency parameter参数以消除假点(本实验中该值为1)。保留这些参数用于所有本实验中需要比较的2DE凝胶图。为了更能准确地反映实验和对照组在蛋白质表达量上的差异，我们将其各自3次重复的胶组合成平均胶，再相互比较计算对应蛋白质点之间量的关系。

　　1.3.6 酶解和飞行时间质谱分析 酶解后的冻干样品用饱和的CHCA溶液按1∶3混合，混匀后取0.5μL点样至样品靶上，待室温晾干后进行飞行时间质谱测定。测定采用线性模式、正离子谱测定，离子源加速电压为20kV，离子延迟提取300ns，质谱信号单次扫描累加50次，并用血管紧缩素Ⅱ(平均分子质量：912.08ku)、血管紧缩素Ⅰ(平均分子质量：1296.50ku)，促肾上腺皮质素片段(1～17，平均分子质量：2093.46ku)和胰岛素B链(平均分子质量：3495.95ku)作为内标校正质谱峰，获得肽质量指纹图(PMF)。用Analysis 5.0对PMF进行基线校正，平滑和质量校准后，提取肽质量数。肽质量数输入Aldente 检索软件(http://cn.expasy.org/tools/aldente/)进行蛋白质鉴定。搜索参数设置如下：数据库选择UniProtKB/TrEMBL and UniProtKB/SWISSPROT，分子质量范围为所实验获得表观分子量的±20ku，等电点范围3～10，酶解片段不完全(Missed cleavages)值为1，人种(Homo sapiens taxon)，翻译后修饰选择propionamide(PAM)，Oxidation Met(MSO)，phosphorylation[P(ST)]和phosphorylation[P(Y)];肽段质量数检索阀值为：shift max 0.2, slope max 200，internal error max 50，minimum number of hits 4和pvalue max 1e5;选择所有的统分参数并且选择随机序列统计模式。

　　2 结 果

　　2.1 三羟基异黄酮的生长抑制作用 为了探究低浓度的异黄酮对MCF7细胞是否具有生长抑制作用，我们用含25μmol/L异黄酮的培养液将MCF7细胞在96孔板里培养0～7d，分别进行MTT分析(图1)。

　　结果表明从加入异黄酮后的第2天开始，25μmol/L的异黄酮对MCF7就具有明显的生长抑制作用。其抑制效果可达正常生长的50%左右。另一方面，我们将对数生长期的MCF7细进行了同样浓度的培养以观察其形态的变化。通过对细胞形态的比较，发现2d后仅有少量的细胞发生皱缩和膜泡沫化现象。但是4d后大量的细胞出现了细胞凋亡的多态性特征。而且大多数细胞从培养皿壁上脱离，尽管这时还是可以看见一部分细胞仍然附着在培养皿壁上。这些附着的细胞在形体上均大于对照的细胞，进一步的放大观察可见这些细胞内有较多的空泡(图2)。这些现象表明大豆异黄酮诱导了大多数MCF7细胞的调亡，而那些没发生调亡的细胞则出现了分化的趋势，种现象与采用高浓度的三羟异黄酮的研究结果类似[11]。

　　2.2 2DE比较分析 细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中培养4d后收集，并根据1.3.3将细胞总蛋白分级为疏水蛋白和水溶性蛋白。由于细胞大多数蛋白为水溶性蛋白，本实验中采用pH 4～7和pH 6～11两种窄范围的IPG胶条分离，以便更有效地呈现较多的蛋白质点。同时，为了便于后续的质谱鉴定，将上样量增加到60μg。而疏水蛋白含量本来就较低，我们采用pH 3～10的IPG胶条。2DE胶经银染、扫描后结果如图3所示。用ImageMastert 2D Platium Software 5.0进行点的检测、匹配、归一化，对照和实验组的pH 4～7凝胶图可分别检测到620±12个蛋白点和630±10个蛋白点;分析发现，平均表达量差异在2倍(Students t检验，P<0.05)以上的蛋白点有15个相对于对照细胞，其中表达量上调2倍以上的点有10个，下调2倍以上的有5个。对pH 6～11的分析表明，在对照和实验组分别检测到800±15个蛋白质点和850±13个蛋白质点。其中表达量上调2倍以上的有23个点，下调的有12个点。对pH 3～10的2DE凝胶图谱分析比析表明，对照组共检测到1300±27个蛋白质点，而实验组则有1357±30个点;其中有45个蛋白质点表达量上调2倍以上，21个点表达量至少下调了2倍。总体上加药处理导致了更多的蛋白质表达量上调。

　　2.3 质谱鉴定 将上述差异点从胶上切离，进行胶内原位酶解，再用MALDITOFMS分析得到蛋白点的PMF，经蛋白数据库检索，成功鉴定出24种蛋白质(表1)，其中仅有5种蛋白在异黄酮培养后表达量有了明显的下调(点4、11、12、20、21)，而其余的则都得到了不同程度的上调(不小于2倍)。这些鉴定的蛋白按功能可分为：①分子伴侣[60ku heat shock protein(HSP60，热休克蛋白60)、stress70 protein(HSP70，热应激蛋白70)];②细胞骨架类蛋白[vimentin(波形蛋白)、TRIO and Factinbinding protein(Tara蛋白)、actin cytoplasmic 1(Betaactin，肌动蛋白β链)];③代谢相关的酶类[glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase(3磷酸甘油醛脱氢酶)、peroxiredoxin1(过氧化物酶1)、Thymidine kinase(胸苷激酶)、carbonic anhydraserelated protein 10(碳酸酐酶相关蛋白10)、caspase1、glycerol kinase(甘油激酶)];④受体类蛋白[osteoprotegerin(护骨素)、HLA class II histocompatibility antigen(组织相容性HLA Ⅱ抗原)];⑤转录因子[leupaxin(LPXN，桩蛋白)、Alphaenolase(α烯醇化酶)、voltagedependent anionselective channel protein 1(VDAC1，电压依赖性阴离子通道1)];⑥GTP结合蛋白[rasrelated protein Rab7(RAB7A，Rab7 ras相关蛋白)、glutamate dehydrogenase 1(GDH，谷氨酸脱氢酶1)];⑦信号转导分子[annexinA1(ANX1，膜联蛋白1)、annexinA2(ANX2，膜联蛋白2)];⑧其他[Poly(rc)表1 差异蛋白鉴定结果

　　3 讨 论

　　本实验中我们用25μmol/L的三羟异黄酮培养MCF7细胞，在加药后的第2天便开始显现生长受抑制的现象(图1)，并在第4天后细胞开始凋亡或出现漂浮。2DE的分析结果表明许多蛋白质的表达量都有较大的改变。对选取的蛋白质点进行质谱鉴定表明这些蛋白质承担了应激、诱导凋亡、维持细胞形态等多种功能。

　　热激蛋白(HSPs)是细胞在一些应激条件，如热休克、物理、化学刺激时有高效表达的一族蛋白。体外和体内实验都已证明，HSP60可与未折叠蛋白结合，并且可降低折叠时的能量障碍或降低中间物对凝聚的敏感性。以外，HSP60还协助某些蛋白，如细胞色素从基质到线粒体内膜空间的运输。研究表明HSP60在许多肿瘤中均有高表达[12]，且HSP60与表达于乳腺癌细胞膜的A3B1整合素结合[1314]，提高后者活性，而肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭力的大小都依赖于A3B1整合素的活性，据此认为HSP60在乳腺癌细胞的转移中发挥了重要作用。与此类似，HSP70也是热激蛋白家族中另一种重要的分子伴侣。该蛋白往往在细胞受到外界压力以及蛋白损坏时表达量显著提高，这种现象也在其他种类的癌细胞中得到了印证[15]。然而也有例外[16]。在三羟异黄酮的作用下乳腺癌细胞中HSP60、HSP70表达量的显著上调，说明异黄酮确实对MCF7细胞的生长造成损伤或者压力，引起了其自身的挽救反应(salvage reponse)。这也说明HSP70具有抑制细胞凋亡的作用，有研究据此认为该蛋白可能拥有致癌活性[17]。

　　细胞骨架蛋白在维持细胞形态、参与细胞运动起到关键的作用，而且与细胞的分裂、分化、凋亡、癌变等细胞生理功能的改变密切相关。肌动蛋白(Actin)是微丝的主要组成成分之一，其结构或功能的改变能有效地导致细胞凋亡[18]。肌动蛋白结构的改变促进细胞质内小泡形成，并最终形成凋亡小体。已知用三氧化二砷的抗癌作用主要与其诱导细胞内Ezrine(一种能与细胞骨架发生相互作用的关键蛋白)和肌动蛋白的减少有关。其机制可能是砷剂通过bcl2蛋白家族，经由Fas途径激活了caspase族蛋白水解酶。而caspase的活化后，可使细胞肌动蛋白、层黏连蛋白(laminin)等多种作为细胞骨架的基础蛋白发生水解[19]，从而导致细胞所黏附的基质或周围细胞群中脱离。

　　线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白(voltagede

　　pendent anion selective channel protein 1, VDAC)可以在线粒体外膜以及质膜中形成通道。它在线粒体上形成的通道允许小分子亲水化合物的进出，而其在质膜上的通道则涉及到细胞大小的调控和凋亡。当通道处于低电位时关闭，而电位在30～40mV通道开放。这种开关的机制可能参与了线粒体诱导凋亡物质的释放。VDAC参与细胞的凋亡过程，主要是通过动态生成一种叫做线粒体通透性转变孔道(mitochondrial permeability transition pore, mt PTP)的复合物。动态的mt PTP由线粒体各部分的蛋白质与细胞质中蛋白质联合构成，包括细胞液蛋白己糖激酶(hexokinase, HK) 、线粒体外膜蛋白外周苯并二嗪受体(peripheral benzodiazepine receptor, PBR)和VDAC、线粒体膜间间隙蛋白肌酸激酶、线粒体内膜蛋白ANT、线粒体基质蛋白亲环蛋白D(cyclophilin D)等。mt PTP有开放和关闭两种构象，开放导致细胞凋亡，而关闭能防止细胞凋亡。随着mt PTP的开放，细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor)和细胞色素C(Cytc)从线粒体内释放进入细胞质,在细胞质中Cytc首先与凋亡蛋白酶激活因子21(apoptosis protease activating factor 21, Apaf21)及pro2 caspase 29(caspases家族成员，激活caspases的起始因子)结合，形成激活的Apaf21和caspase 29[20]。此后,激活的Apaf21和caspase29作用于具有蛋白水解活性的caspases。

　　膜联蛋白属于钙依赖性磷脂结合蛋白家族。ANX1在体内参与一系列细胞生命活动，包括抗炎反应、细胞黏附与迁移、细胞增殖及凋亡等。研究表明乳腺导管凋亡中ANX1的表达显著上调。引起这一现象的主要原因是ANX1表达的改变影响了Caspase3的活化和钙离子的释放，从而促进细胞凋亡[21]。此外，外源性的ANX1可通过提高细胞内钙离子浓度和Bc12/Bc1xL相关死亡促进因子(Bc12/Bc1xL2

　　associated death promoter, BAD)的去磷酸化而诱导细胞的凋亡[22]。也有许多研究表明ANX1表达的升高与肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)呈正相关性：转染ANX1的乳腺癌细胞系MCF7对阿霉素、马法兰、依托泊苷的耐药性提高2～5倍[23]。

　　综上所述，低浓度的三羟异黄酮诱导的MCF7细胞的凋亡，可能通过激活caspase族水解酶，从而使蛋白质骨架蛋白质发生水解，进而引起一系列功能蛋白表达水平的变化，最终导致了细胞的凋亡。此外，本实验中也观察rasrelated protein Rab7、2oxoisovalerate、

　　osteoprotegerin、dehydrogenase alpha subunit、以及glycerol kinase等蛋白表达量的改变。它们如何参与细胞的生长、凋亡及信号转导等方面仍不清楚，还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]VALACHOVICOVA T, SLIVOVA V, SLIVA D. Cellular and physiological effects of soy flavonoids [J]. Mini Rev Med Chem, 2004, 4:881887.

　　[2]RAXVINDRANATH MH, MUTHUGOUNDER S, PRESSER N, et al. Anticancer therapeutic potential of soy isoflavone genistein [J]. Adv Exp Med Biol, 2004, 546:121165.

　　[3]KIM EJ, SHIN HK, PARK JH. Genistein inhibits insulinlike growth factorI receptor signaling in HT29 human colon cancer cells: a possible mechanism of the growth inhibitory effect of Genistein [J]. J Med Food, 2005, 8:431438.

　　[4]XU J, LOO G. Different effects of genistein on molecular markers related to apoptosis in two phenotypically dissimilar breast cancer cell lines [J]. J Cell Biochem, 2001, 82(1):7888.

　　[5]PETERSON G, BARNES S. Genistein inhibition of the growth of human breast cancer cells: independent from estrogen receptors and the multidrug resisitance gene [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 179(1):661667.

　　[6]PETERSON G, BARNES S. Isoflavones inhibit the growth of human prostate cancer cell lines without inhibiting epidermal growth factor receptor autophosphorylation [J]. Prostate, 1993, 22:335345.

　　[7]MURATA M, MIDORIKAWA K, KOH M, et al. Genistein and daidzein induce cell proliferation and their metabolites cause oxidative DNA damage in relation to isoflavoneinduced cancer of estrogensensitive organs [J]. Biochemistry, 2004, 43:25692577.

　　[8]LIU N, BI F, PAN Y, et al. Reversal of the malignant phenotype of gastric cancer cells by inhibition of RhoA expression and activity [J]. Clin Cancer Res, 2004, 10:62396247.

　　[9]LENNER I, NIEHOF M, BORLAK J. An optimized method for the isolation and identification of membrane proteins [J]. Electrophoresis, 2003, 24:19751808.

　　[10]SHEVCHENKO A, WILM M, VORM O, et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silverstained polyacrylamide gels [J]. Anal Chem, 1996, 68:850858.

　　[11]XU J, LOO G. Different effects of genistein on molecular markers related to apoptosis in two phenotypically dissimilar breast cancer cell lines [J]. J Cellular Biochem, 2001, 82:7888.

　　[12]CAPPELLO F, BELLAFIORE M, PALMA A, et al. 60kDa chaperonin (HSP60) is overexpressed during colorectal carcinogenesis [J]. Eur J Histochem, 2003, 47:105110.

　　[13]KLEIN SD, BRUNE B. Heatshockprotein 70 attenuat tricoxideinduced apoptosis in RAW macrophages by venting cytochromecrelease [J]. Biochem J, 2002, 362:365641.

　　[14]BARAZI HO,ZHOU L,TEMPLETON NS, et al. Identification of heat shock protein 60 as a molecular mediator of alphata 3beta 1integrin activation [J]. Cancer Res, 2002, 62(5):15411548.

　　[15]LUK JM, LAM CT, SIU AF, et al, Proteomic profiling of hepatocellular carcinoma in Chinese cohort reveals heatshock proteins (Hsp27, Hsp70, GRP78) upregulation and their associated prognostic values [J]. Proteomics, 2006, 6:10491057.

　　[16]MOE T, TAKAKO A, RENA T, et al. Puma is a novel target of soy isoflavone genistein but is dispensable for genisteininduced cell fate determination [J]. Mol Nutr Food Res, 2008, 52:439446.

　　[17]GARRIDO C, SCHMITT E, CANDE C, et al. HSP27 and HSP70: potentially oncogenic apoptosis inhibitors [J]. Cell Cycle, 2003, 2:579584.

　　[18]KISELYOV A, BALAKIN KV, TKACHENKO SE, et al. Recent progress in discovery and development of antimitotic agents [J]. Anticancer Agents Med Chem, 2007, 7(2):189208.

　　[19]SEOL JG, PARK WH, KIM ES, et al. Potential role of caspase3 and 9 in arsenic trioxide mediated apoptosis in PC1 head and neck cancer cells [J]. Int J Oncol, 2001, 18(2):249255.

　　[20]SUSIN SS, EARNSHAW WC. Apoptosis: a cellular poison cupboard [J]. Nature, 1999, 397(6718):38723890.

　　[21]LIM LH, PERVAIZ S. Annexin 1: the new face of an old molecule [J]. FASEB J, 2007, 21(4):968975.

　　[22]SOLITO E, KAMAL A, RussoMarie F, et al. A novel calciumdependent proapoptotic effect of annexin 1 on human neutrophils [J]. FASEB J, 2003, 17:15441546.

　　[23]WANG Y, SERFASS L, ROY MO, et al. AnnexinI expression modulates drug resistance in tumor cells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314:56557.(编辑 胡爱玲)