小脑间位核至下丘脑的神经投射及其性质

　　【摘要】 目的：探讨大鼠小脑间位核至下丘脑的神经投射及其性质，为小脑-下丘脑路径参与调节免疫功能提供证据。方法：电泳神经顺行追踪剂葡聚糖-德克萨斯红(Dextran-Texas Red, Dextran-TR)观察小脑间位核投射至下丘脑的神经纤维的存在和行走路径;电泳神经逆行追踪剂Fluoro-Ruby逆行追踪投射到下丘脑的间位核神经元;免疫荧光双标法观察投射到下丘脑的间位核神经元的性质。结果：小脑间位核电泳Dextran-TR后示踪可见间位核神经元发出离核纤维，行走于同侧小脑上脚中，在小脑上脚交叉处交叉到对侧，然后继续走行于小脑上脚中，到下丘脑后较多纤维终止于下丘脑后区;在下丘脑后区电泳Fluoro-Ruby后可逆行追踪到小脑间位核神经元，荧光双标法显示投射到下丘脑后区的小脑间位核神经元中有谷氨酸能神经元。结论：小脑间位核有向下丘脑投射的直接纤维，其中有些神经元的性质是谷氨酸能的。

　　【关键词】 免疫调节功能;小脑;间位核;下丘脑;谷氨酸

　　Nerve projection and property from cerebellar interposed nucleus to hypothalamus

　　LU Jianhua, QIU Yongjuan, MAO Hainü, et al (Department of Physiology, Medical College, Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To explore the nerve projection and property from cerebellar interposed nucleus (IN) to hypothalamus in rats and so as to provide more information for immunomodulation mediated by cerebello-hypothalamic pathway. Methods: The iontophoresis of Dextran-Texas Red, neuronal anterograde tracer, was used to observe the existence and routes of nerve projection from cerebellar IN to hypothalamus. The iontophoresis of Fluoro-Ruby, neuronal retrograde tracer, was used to trace neurons projecting to hypothalamus in cerebellar IN. Immumofluorescence method of double labelling staining was used to identify the neurotransmitters of cerebellar IN projecting to hypothalamus. Results: It was observed that projections from IN to hypothalamus passed through the superior cerebellar peduncle, crossed in its decussation and then many of them entered posterior hypothalamic area (PH) by iontophoresis of Dextran-Texas Red to cerebellar IN. Using the methods of iontophoresis of Fluoro-Ruby and double labelling staining, it was also observed that the neurons projecting to PH in cerebellar IN were glutamatergic neurons. Conclusions: There are direct fibers from cerebellar IN to hypothalamus, and some of them are glutamatergic.

　　[Key words] Immunomodulation;Cerebellum; Interposed nucleus; Hypothalamus; Glutamate

　　小脑是中枢神经系统重要的组成部分，但可能由于受它的躯体运动调节功能这一传统观念的限制，因而对小脑与免疫功能关系的研究目前还很少。我们实验室研究发现小脑顶核和间位核参与了免疫功能的调节[1-4]。然而，小脑与淋巴细胞之间没有直接的神经纤维联系。已有大量的研究表明，下丘脑具有明显的免疫调节作用，且下丘脑可通过自主神经系统和内分泌系统直接与外周淋巴细胞接触，从而调节淋巴细胞功能[5-7]。本实验旨在证实小脑间位核有直接纤维投射至下丘脑的基础上进一步明确纤维的性质，初探小脑参与免疫功能调节的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物来源 SD大鼠(南通大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重200~220 g。

　　1.2 主要仪器和试剂 动物立体定位仪(KOPF 902-A, USA)，倒置研究型显微镜(Leica, Germany)，冰冻切片机(Leica CM 1900, Germany)，低温冰箱(NUAIR 2100, Japan)，微电极拉制仪(PP830, Narish, Japan)，Dextran-TR(Invitrogen)，Fluoro-Ruby(Invitrogen)，兔抗谷氨酸多克隆血清(Sigma)，Alexa Fluor350标记的羊抗兔IgG(Invitrogen)

　　1.3 小脑间位核内、下丘脑后区内电泳追踪剂 首先拉制玻璃微电极，电极尖端外径为20~25 μm。取SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠24 mg/kg。待动物麻醉后将其固定于立体定位仪上。参考Paxinos和Watson[8]大鼠脑立体定位图谱，以前囟平面为参考平面，确定间位核坐标：A/P：11.2 mm;L/R：2.2 mm;H：6.3 mm。下丘脑后区坐标：A/P：3.60 mm;L/R：0.6 mm;H：8.2 mm。用虹吸法将追踪剂吸入微电极内，将细铜丝插入电极内与追踪剂溶液接触，铜丝与电泳仪的正极相接，负极连于剪开的动物皮肤或肌肉上。将电极定位插入间位核或下丘脑后区后，电泳15~20 min，电流强度为5~6 μA，电流通7 s断7 s。

　　1.4 灌注、固定、切片 电泳入追踪剂的大鼠常规饲养 8 天后，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg，开胸暴露心脏，自心尖将灌注针头插入左心室，灌注生理盐水100~200 ml后，快速灌注预冷(4 ℃)的含4%多聚甲醛的0.1 M PBS(pH 7.2)，待动物全身抽搐后再慢滴，持续约40 min。立刻取脑放入同样的灌注液中后固定 2~4 h，随后经20%、30%蔗糖脱水。小脑至下丘脑行冠状连续冰冻切片，片厚30 μm。

　　1.5 免疫荧光反应 将切片置入0.3% Triton X-100、3%正常山羊血清中室温封闭30 min，兔抗谷氨酸多克隆血清(1∶500稀释)4 ℃ 72 h，Alexa Fluor350标记的羊抗兔IgG(1∶200稀释)4 ℃ 48 h，各步骤间用0.01 M PBS(pH 7.3)充分漂洗。

　　1.6 荧光显微镜观察 Dextran-TR的激发光是595 nm, 被其标记的神经元胞体和纤维呈红色;Fluoro-Ruby的激发光是540 nm, 被其标记的神经元胞体和纤维也呈红色;谷氨酸免疫阳性神经元呈蓝色。红蓝双标的神经元呈洋红色。

　　2 结 果

　　2.1 小脑间位核神经元的轴突投射至下丘脑的路径 小脑一侧间位核内电泳5% Dextran-TR 8天后，动物灌注、取脑、固定、切片。在荧光显微镜下可见，电泳部位基本限定在间位核内(图1)。被标记的神经纤维形似条索状或点状，在小脑上脚中行走(图2)，并在小脑上脚交叉中交叉至对侧(图3)，然后继续走行于小脑上脚中，到达下丘脑后较多纤维投射至下丘脑后区(图4)。

　　2.2 投射至下丘脑后区的小脑间位核神经元中含有谷氨酸能神经元 在下丘脑后区内电泳10% Fluoro-Ruby 8天后，动物灌注、取脑、固定、切片。在荧光显微镜下可见，电泳部位位于下丘脑后区(图5)，小脑间位核内追踪到逆行标记的神经元，神经元胞体和纤维呈红色(图6)。谷氨酸免疫荧光显示小脑间位核内有谷氨酸阳性神经元，胞体和纤维呈蓝色(图7)。红色和蓝色双标的神经元呈洋红色(图8)，表明该神经元是由小脑间位核投射到下丘脑后区的谷氨酸能神经元。

　　3 讨 论

　　小脑由外部的皮层和深部的3对核团组成，小脑的所有调节功能均由其3对核团输出。我们先前的研究说明，小脑2对核团—顶核和间位核均可调节免疫功能。但由于小脑与免疫系统之间没有直接的神经联系，因而探索小脑免疫调节的路径显得尤为重要。已知下丘脑是内脏活动、自主神经和内分泌功能的调节中枢，且已有很多报道说明下丘脑是调节免疫功能的重要中枢。因而，我们推测小脑的免疫调节功能有可能通过下丘脑路径实现。神经解剖学研究发现，小脑与下丘脑之间存在着直接的双向神经纤维联系，即小脑核团的神经元轴突组成的离核纤维直接投射到下丘脑，而下丘脑也有神经纤维直接投射到小脑[9-10]。但对于小脑核团投射到下丘脑的纤维性质国内外还未见报道。本研究中，我们利用神经束路顺行追踪法观察到，小脑间位核的神经元发出纤维行走于同侧的小脑上脚中，在小脑上脚交叉处交叉到对侧，行走于对侧的小脑上脚中，然后较多纤维终止于下丘脑后区;我们又用逆行追踪论证了投射到下丘脑后区的神经纤维有来自于小脑间位核的神经元;最后，我们利用免疫荧光双标法观察到投射至下丘脑后区的小脑间位核神经元中含有谷氨酸能神经元，提示这种小脑—下丘脑的谷氨酸能神经投射有可能参与小脑的免疫调节功能，进一步的证据正在探索中。

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