人前脑啡肽原绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

　　作者：李永辉1，胡伊乐1，涂心明1，臧卫东2　    作者单位：1.河南科技大学医学院，河南洛阳 471003　2.郑州大学基础医学院，河南郑州 450052

     【摘要】 目的 构建人前脑啡肽原(preproenkephalin,PENK)绿色荧光真核表达载体并进行鉴定。方法 参照PENK基因全序列，在cDNA两端各设计一条对应引物，并引入各自酶切位点。通过RTPCR的方法从正常人脑组织中扩增出目的基因，并定向克隆至pEGFPC3绿色荧光蛋白真核表达载体上。筛选阳性克隆，通过双酶切和测序法鉴定重组质粒。结果 双酶切结果与目的基因表达的条带完全吻合，克隆测序结果与NCBI收录的PENK序列完全一致。结论 成功构建pEGFPC3PENK载体，为进一步研究疼痛的基因治疗奠定基础。

　　【关键词】 绿色荧光载体;真核表达;人前脑啡肽原

　　Construction of Human PENK and Green Fluorescent

　　Protein Eukaryotic Vector

　　LI Yonghui, HU Yile, TU Xinming, et al

　　(Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

　　Abstract:Objective To construct and identify the human PENK and green fluorescent protein eukaryotic vector. Methods To correspond to the PENK gene sequences, introduce respective restriction sites in each end of cDNA; and obtain the target gene from the normal tissue of brain by RTPCR, then connect the target gene to the pEGFPC3 green fluorescent protein eukaryotic vector; and choose the positive clones to identify the recombinant plasmids by double disgestion and sequencing. Results Double disgestion results and the expression of target gene band matched completely; the clone sequencing results were the same as the sequence of PENK contained in NCBI results. Conclusion pEGFPC3PENK vector is successfully constructed for the further study of the gene therapy of pain.

　　Key words:green fluorescent vector;eukaryotic expression; PENK

　　癌症晚期病人的疼痛治疗是目前医疗界的一项难题，传统的阿片类镇痛药物虽有较好的效果，但由于其具有成瘾性、呼吸抑制等副作用限制了在临床上的使用[1]。20世纪80年代以后，基因技术的快速发展为疼痛的基因治疗开辟了一个新时代 [2，3]。脑啡肽[4，5]是机体自身合成的一种内源性阿片肽，无阿片类药物的副作用且有较好的镇痛作用，目前已经成为疼痛研究的一个新方向。本实验将人体内控制脑啡肽合成的前脑啡肽原基因与pEGFPC3载体连接，构建成前脑啡肽原绿色荧光真核表达载体，为进一步研究疼痛的基因治疗奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 脑组织来源 取自郑州大学第一附属医院因颅脑外伤意外死亡患者的脑组织(死亡0.5 h内)。

　　1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒cDNA 第一链合成试剂盒、DNA Marker、DNA胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶均购于大连宝生物公司;JM109菌、pEGFPC3质粒由郑州大学基础医学院人体解剖学实验室保存;PE4800型PCR仪产自美国PE公司;722型电泳仪、水平电泳槽产自上海医疗器械厂;其他普通试剂购于国内各大试剂公司。

　　1.3 总RNA的提取 无菌条件下取出脑组织，按照大连宝生物公司的总RNA提取试剂盒说明书操作，具体步骤如下：①在超净工作台中取脑组织，在冰盒上切成约100 mg的小块，置于1.5 mL离心管中及时使用或-80℃冻存备用。②取一块100 mg的脑组织置于研磨器中加入液氮迅速用力研磨3～5次。③加入450 μL RLT solution，用力晃动或用枪头吹打使其混匀，充分裂解后将裂解液吸入RNasefree的EP管中，在56℃水浴3 min。④水浴完成后加入250 μL的无水乙醇。⑤取700 μL的样品放于2 mL收集管中的过滤柱中。置于低温离心机中4℃ 8 000 r/min离心1 min。⑥倒去收集管中的废液，加入500 μL的RW solution于柱中，静置1 min，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心1 min。⑦倒去收集管中的废液，加入500 μL的RPE solution于柱中，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心1 min，重复⑤1次。⑧倒去收集管中的废液，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心15 s。⑨将滤柱放入无菌的RNasefree的1.5 mL离心管中，加30～50 μL DEPCH2O到柱膜中央，在50℃恒温水浴锅中放置2 min，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心1 min，收集，分为10 μL/管，-70℃冻存或立即使用。

　　1.4 RTPCR 根据GenBank报道的人前脑啡肽原基因序列, 使用Primer5.0设计引物，上游和下游引物分别加上HindⅢ和BamHI的酶切位点，

　　F：5ˊGAAAAGCTTATGGCGCGGTTCCTGACA3ˊ

　　R：5ˊGCCGGATCCTTAAAATCTCATAAATCCTC 3ˊ通过RTPCR扩增PENK目的基因。总RNA先70℃变性5 min，冰浴冷却后加入反应体系，反应物总体积为20 μL，离心混匀后，置于42℃恒温水浴锅中水浴1 h，然后移至70℃水浴5 min灭活反转录酶，产物为人脑组织的总cDNA。反应结束后，取PCR反应液5 μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳，观察PCR的扩增产物。

　　1.5 TPENK载体的构建 利用胶回收试剂盒将PCR产物的DNA目的片段纯化回收，将回收片段与T载体连接，转染大肠杆菌 JM109，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，对阳性克隆扩大培养提取TPENK重组质粒。

　　1.6 pEGFPC3PENK真核表达载体的构建及鉴定 按1∶3比例将TPENK载体和pEGFPC3载体混合后用HindⅢ和BamHI双酶切成线状并经电泳回收，混合后16℃连接过夜，连接产物用42℃水浴热击法转入JM109感受态细菌内铺含Amp+的琼脂平板，倒置37℃培养12～16 h，通过菌落PCR和酶切法鉴定阳性克隆，并取PCR阳性克隆菌送上海生物工程公司测序。

　　2 结果

　　2.1 人前脑啡肽原基因的克隆 通过RTPCR法扩增出的PENK基因与预测的基因基本一致(见图1)。

　　1：Marker 2：针对pEGFPC3设计的引物所扩PENK基因

　　图1 人前脑啡肽原基因的PCR电泳图

　　2.2 重组质粒的双酶切鉴定与测序结果 从图2中可以看出，酶切出约800 bp(PENK)和5 000 bp (pEGFPC3)的DNA片段。与理论计算一致，命名为pEGFPC3PENK。测序结果与GenBank报道的序列完全吻合，载体构建成功。

　　1：Marker 2、3：酶切新载体所得PENK和pEGFPC3片段

　　图2 构建新载体的酶切电泳图

　　3 讨论

　　疼痛治疗是医学界的长期研究课题。目前缓解疼痛的主要治疗药物仍是阿片类药物，其成瘾性和毒副作用大等特点又使其临床应用受限。脑啡肽是一种神经递质，阿片受体的内源性配体,通过阿片受体介导的抑制腺苷酸环化酶、抑制磷脂酰肌醇水解等细胞内信号传导途径发挥作用。脑啡肽包括甲硫氨酸脑啡肽(MEK)和亮氨酸脑啡肽(LEK)具有镇痛效果好、副作用少的优点，但脑腓肽易被脑啡肽酰A或B降解成无活性的衍生物，因此找到一种持续分泌内源性脑啡肽，且具有临床可行性的方法，成为研究的主要方向。前脑啡肽是脑腓肽的前体,在翻译过程中经不同的蛋白酶降解形成上述两个具有镇痛作用的活性阿片肽。前脑啡肽源基因是慢性疼痛基因治疗中一种较为理想的基因选择，是目前国内外研究的热点。杨茂元等[6]先用在脂质体介导下将人前脑啡肽源基因(human preproenkephalin，HPPE)转染鼠成纤维细胞系NIH/3T3细胞，然后将该细胞移植入大鼠的蛛网膜下腔进而评价神经性疼痛治疗的效果，结果表明成纤维细胞系NIH/3T3能表达β内啡肽基因，HPPE作为转基因镇痛治疗难治性疼痛是可行的。基因镇痛研究中常用的载体有病毒载体与非病毒载体，病毒载体携带外源基因和相关基因元件，并被包装成病毒颗粒可整合入不能分裂增殖神经元细胞内进行表达。在体内外实验中使用较多，但其来源于病毒存在自身免疫原性和造成细胞病理改变等特性，其临床应用也受到限制[7]。而非病毒基因载体则以其设计灵活、低免疫原性、低毒性、低致癌性、外源基因整合几率低、无基因插入片段大小限制、易制备、长期表达等优点，成为基因治疗新选择。在国内华中科技大学徐颖等[8]人，将前脑啡肽基因连接到真核载体上，利用逆转录病毒四环素调控系统,建立四环素调控表达人前脑啡肽原基因的大鼠星形胶质细胞系，将来移植到体内，可依据疼痛程度，调控疼痛基因表达时间与水平，这使得基因治疗与临床应用又近了一步。

　　我们在前期试验中将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接，构建重组质粒pcDNA3.1(+)–EGFP，鞘内直接注射将重组质粒注入大鼠的蛛网膜下腔，绿色荧光显示新构建的质粒虽未整合入神经元细胞，但被蛛网膜下腔上皮细胞摄取并表达。随后又将前脑啡肽原(PENK)基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接，鞘内直接注射将重组质粒注入坐骨神经慢性压迫模型大鼠的蛛网膜下腔，产生较好和较长时间的镇痛效果。为了进一步研究前脑啡肽基因在体内被体细胞摄取表达的部位。

　　本实验将人前脑啡肽基因(PENK)连接到绿色荧光载体(pEGFPC3)上，构建pEGFPC3PENK载体，为后续疼痛基因治疗的体内外实验奠定了分子生物学基础。

　　【参考文献】

　　[1] Gerra G,Maremmani I,Capovani B,et al.Longacting opioidagonists in the treatment of heroin addiction: why should we call them“substitution”[J].Subst Use Misuse,2009, 44(5) :663-671.

　　[2] Glorioso JC,Fink DJ.Gene therapy for pain:introduction to the special issue[J].Gene Ther, 2009, 16(4):453-454.

　　[3] Federici T,Boulis N.Gene therapy for peripheral nervous system diseases[J].Curr Gene Ther, 2007, 7(4):239-248.

　　[4] Pinto M,Castro AR,Tshudy F,et al.Opioids modulate pain facilitation from the dorsal reticular nucleus[J]. Mol Cell Neurosci, 2008,39(4):50.

　　[5] Xu W,Sanz A,Pardo L,et al.Activation of the mu opioid receptor involves conformational rearrangements of multiple transmembrane domains[J].Biochemistry, 2008, 47(40): 10576-10586.

　　[6] 杨茂元,毕好生,郑从义,等.蛛网膜下腔移植转脑啡肤基因细胞用于治疗神经性 疼痛[J].中华麻醉学杂志, 1999, 19(12):722-724.

　　[7] 臧卫东. APA微囊化转前脑啡肽原基因细胞移植镇痛的实验研究[D].郑州大学，2006：97-99.

　　[8] 徐颖, 田玉科, 田学愎, 等. 可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建[J].第四军医大学学报, 2006, 27(5):400-403