环孢素A对肾小管上皮细胞MMP-2和MMP-9表达和活性的影响
作者：岳智慧， 孙良忠?鄢， 李易娟， 莫 樱， 蒋小云， 陈述枚 作者单位：(中山大学附属第一医院儿科， 广东 广州 510080
【摘要】 【目的】 观察环孢素A(CSA)对近端肾小管上皮细胞基质金属蛋白酶-2和-9(MMP-2 和 MMP-9)表达和活性的影响。【方法】 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK52E细胞至完全融合时，分别给予不同浓度的CSA 0，0.42，0.84，4.2，8.4 ?滋moL/L，实验观察48 h和72 h。收集培养液，用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性。提取总RNA，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MMP-2和MMP-9的mRNA水平。 【结果】 CSA刺激NRK52E细胞呈剂量依赖性抑制MMP-2活性和mRNA表达。与对照组(CSA 0 ?滋moL/L)比较，CSA0.42，0.84，4.2，8.4 ?滋moL/L的MMP-2活性分别下降为27%，24%，11%，9%;差异均有统计学意义，P < 0.05。CSA刺激NRK52E细胞增加MMP-9活性和mRNA表达。与对照组比较，CSA 4.2 ?滋moL/L 刺激48 h MMP-9活性上调为438%，72 h上调为237%，差异均有统计学意义，P < 0.05。 【结论】 CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性呈剂量依赖性抑制，以及对MMP-9表达和活性的诱导作用可能与CSA所致肾小管间质损害相关。
【关键词】 环孢素A; 基质金属蛋白酶; 肾小管上皮细胞
Effect of Cyclosporine A on Activity and Expression of MMP-2 and MMP-9in Renal Tubular Epithelial Cells
YUE Zhi-hui， SUN Liang-zhong， LI Yi-juan， MO Ying， JIANG Xiao-yun， CHEN Shu-mei
(Department of Pediatrics， The First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China)
Abstract： 【Objective】 To observe the effect of cyclosporine A (CSA) on the activity and expression of MMP-2 and MMP-9 in renal tubular epithelial cells. 【Methods】 NRK52E cells were cultured until its reached confluent. Then NRK52E cells were exposed to different concentration of CSA (0， 0.42， 0.84， 4.2， and 8.4 moL/L) for 48 h or 72 h respectively. MMP-2 and MMP-9 activities were detected by gelatin zymography. The expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA were detected by RT-PCR. 【Results】 MMP-2 activity and mRNA levels were decreased in a dose dependent manner after exposed to different concentration of CSA for 48 h or 72 h in NRK52E cells. Compared with control (CSA 0 moL/L)， CSA 0.42， 0.84， 4.2， 8.4 moL/L decreased the MMP-2 activities to 27%， 24%， 11%， and 9% respectively; The differences are significant， P < 0.05. But the MMP-9 activity and mRNA levels were increased after exposed to CSA for 48 h or 72 h in NRK52E cells. Compared with control group， CSA 4.2 moL/L exposure increased MMP-9 activity to 438% in 48 h， and 237% in 72 h; the differences are significant as well， P < 0.05. 【Conclusion】 A dose-dependent decrease in the expression and activity of MMP-2， and the up-regulation of the expression and activity of MMP-9 by CSA in renal epithelial cells may related to CSA associated tubulointerstitial damage.
Key words： cyclosporine A; matrix metalloproteinase; renal tubular epithelial cell
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：91-94;133]
环孢素A(cyclosporine A， CSA)在各种免疫性疾病、肾移植术后和难治性肾病综合征等的治疗中疗效显著，但其潜在的肾毒性使它的临床应用受到了很大的限制。CSA导致肾损害的机制仍未十分清楚。CSA对肾脏的损害一般与剂量相关，病理主要表现为肾小管上皮细胞损害，肾间质纤维化和肾血管病变[1]。基质金属蛋白酶(matrix metaloproteinase， MMP) 是一组降解细胞外基质和基底膜成分的酶类，其中MMP-2和MMP-9属于明胶酶，主要可以降解基底膜的胶原成分，对间质胶原也有一定的降解作用[2]。它们过度表达可破坏肾小管基底膜的完整性，使发生转分化的肾小管上皮细胞可以进入肾间质，促进肾间质纤维化;而表达不足则可导致细胞外基质降解障碍，细胞外基质积聚，同样促进肾间质纤维化[3-5]。但有关CSA对肾小管上皮细胞MMP-2和MMP-9表达和活性的影响，目前报道结果并不一致，增高、降低和无改变均有报道[6-8]。本研究通过观察不同剂量CSA对近端肾小管上皮细胞MMP-2 和 MMP-9表达和活性的影响，以进一步探讨CSA对肾小管间质损害的机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
NRK52E(正常大鼠近端肾小管上皮细胞株，由中山大学附属第一医院肾脏病实验室提供)细胞，接种在10 cm培养皿，培养至完全融合时，去血清培养24 h[9-10]。然后分别给予不同浓度的CSA(美国，辉瑞制药公司)， 浓度范围参照临床用药时肾小管腔内CSA的浓度(0.42 ～ 42 ?滋moL/L)[6，11]，分别给予0，0.42，0.84，4.2，8.4 ?滋moL/L。实验观察48 h和72 h。每项实验重复3 ～ 5次。
1.2 明胶酶谱法
培养液MMP-2和MMP-9活性用明胶酶谱法检测[12]。简述如下，按照上述时间点收集培养液，取等量培养液加入加样缓冲液，在含1 mg/mL明胶的100 g/L聚丙烯凝胶中电泳。电泳结束后，用25 mL/L的Triton X100漂洗凝胶。然后放入缓冲液中37 ℃孵育48 h。5 g/L考马斯亮兰 G250中染色，再用脱色。凝胶中蓝色背景下不着色条带代表酶活性。条带的相对分子量用分子量分析软件(Molecular Analyst version 4.0， Bio-rad)测定分析。用光密度扫描仪(美国Bio-rad)扫描图像，并作光密度分析。条带的范围和反相光密度代表酶的活性高低，以其乘积为实际观测值，用与对照组比较的相对值表示变化程度。
1.3 总RNA提取
总RNA提取：用一步法总RNA提取试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)。简述如下，细胞培养至设定时间后，移除培养液，加入1 mL Redzol裂解细胞，将细胞裂解液转移至离心管，室温静止5 min，加入0.2 mL氯仿振荡混匀，室温静置2 min，1 200 r/min (r = 4.25 cm) 离心15 min，混悬液分为3层，将上层含有总RNA的液体转移至新的离心管，加入0.2 mL无水乙醇，轻轻混匀，将液体转移至过滤柱，室温静置5 min，1 200 r/min (r = 4.25 cm)离心2 min，去除滤液。加入600 μL RNA洗涤液至过滤柱，离心去除滤液，再离心后将过滤柱移至一个新的离心管，加入50 μL DEPC水，静置2 min，离心收集洗脱液，再加入30 μL DEPC水洗脱1次。收集洗脱液，分装，-80 ℃冰箱保存待测。
1.4 逆转录聚合酶链式反应分析
取1 μg总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR)。采用北京赛百盛基因技术有限公司的一步法傻瓜RT-PCR试剂盒。实验步骤参照试剂盒提供的所明书。利用Oliga6.0和primer premier 5.0设计引物。引物序列及反应参数如下： 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，上游： 5′ CAG CCC AGC AAG GAT ACT GA 3′，下游： 5′ TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT 3′。反应参数为45 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，72 ℃ 7 min;共30个循环，扩增片段为191 bp。MMP-2，上游： 5′ TTC TGA CGG GCC GTA CAA TC 3′，下游： 5′ TGG GCG GGA GAA AGT AGC AC 3′。反应参数为45 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，72 ℃ 7 min;共30个循环，扩增片段为208 bp。MMP-9，上游： 5′ CTT TGT AGG GTC GGT TCT G 3′，下游： 5′ CCT GTG AGT GGG TTG GAT T 3′。反应参数为45 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，72 ℃ 7 min;共29个循环，扩增片段为466 bp。各反应以GAPDH作为反应参照，用UVP-2000凝胶图像分析系统进行分析。
1.5 数据统计分析
MMP-2和MMP-9酶活性用与对照组比较的相对值表示其变化程度，MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平用与GAPDH mRNA水平比较的相对值表示。两组间比较用Mann-Whitney检验，多组间比较用Kruskal-Wallis检验，多组间两两比较用Bonferroni修正差别检验法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 CSA刺激NRK52E细胞呈剂量依赖性抑制MMP-2活性和mRNA表达。
明胶酶谱结果显示CSA刺激NRK52E细胞48 h和72 h， 可抑制MMP-2活性。MMP-2(包括对照培养液)主要为活性形式MMP-2，相对分子质量为62 k。与对照组比较，48 h MMP-2活性下调为77%，72 h下调为21%;差异均有显著性，P < 0.05(图1)。CSA对MMP-2活性的抑制呈剂量依赖性，与对照组(CSA 0 ?滋moL/L)比较，CSA0.42，0.84，4.2，8.4 ?滋moL/L的MMP-2活性分别下降为27%，24%，11%，9%;差异均有显著性，P < 0.05(图2)。RT-PCR结果显示CSA刺激NRK52E细胞72 h，呈剂量依赖性抑制MMP-2的mRNA表达(图3)。提示CSA在转录水平对MMP-2的表达起抑制作用。
2.2 CSA刺激NRK52E细胞可增加MMP-9活性和mRNA表达。
明胶酶谱结果显示CSA刺激NRK52E细胞48 h和72 h， 均可增加MMP-9活性。MMP-9(包括对照培养液)主要为前体形式，相对分子质量为92 k。与对照组比较，48 h MMP-9活性上调为438%，72 h上调为237%，差异均有显著性，P < 0.05(图1)。RT-PCR结果显示CSA刺激NRK52E细胞48 h和72 h， 均可增加MMP-9的mRNA表达(图4)。提示CSA在转录水平对MMP-9的表达起上调作用。
3 讨 论
本研究发现，CSA对肾小管上皮细胞MMP-2和MMP-9表达和活性呈相反的调节作用。CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性均有明显的抑制作用，而且呈剂量依赖性。而对MMP-9的表达和活性则有上调作用。由于MMP-2和MMP-9功能和作用底物并不完全一致[2]，CSA对肾小管上皮细胞MMP-2和MMP-9表达和活性呈现的完全不同的调节作用，提示MMP-2和MMP-9在体内可能参与并不一致的病理生理过程。
肾小管上皮细胞向间质细胞转分化(epithelial to mesangial transdifferentiation，EMT)是近年来发现在肾间质纤维化中起重要作用的病理生理过程[3]。MMP-9和/或MMP-2过度表达对破坏肾小管基底膜完整性的破坏是发生EMT关键步骤之一[3，6]。有研究发现[6，11]，体外用CSA处理人近端肾小管上皮细胞，可导致肾小管上皮细胞发生EMT的变化，同时也观察到了基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达和活性升高。因此，CSA对肾小管上皮细胞MMP-9表达和活性的促进作用可能参与了CSA诱导的EMT过程，以及CSA诱导的肾间质纤维化;但这仍需进一步的体内研究证实。
有关CSA对肾小管上皮细胞表达MMP-2表达和活性的研究，目前并无一致的结论。既有报道CSA可以抑制肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性，也有报道增高或无改变的[6-8]。本研究发现，CSA不仅可以抑制肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性，而且呈剂量依赖性。而CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达的抑制作用是否与CSA所致的肾损害相关，仍有待进一步研究证实。
MMP-2也属于明胶酶;但与MMP-9不同的是，MMP-2对间质胶原，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白，均有较强的降解活性[2]。因此，CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性的抑制有可能使细胞外基质的降解受到抑制，导致细胞外基质的积聚，促进肾间质纤维化和肾小球硬化。近年有研究发现[4]，在移植肾肾病的晚期，抑制MMP-2活性可显著加重肾间质纤维化。在单侧输尿管结扎诱发肾间质纤维化的大鼠模型中，无论是早期还是晚期，使用MMP-2抑制剂均可显著加重肾间质纤维化;提示，MMP-2的表达对于肾间质纤维化有抑制作用[13]。因此，CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性的抑制作用可能与CSA诱发的肾间质纤维化有关。
总之，本研究发现CSA对肾小管上皮细胞MMP-2和MMP-9表达和活性呈不同的调节作用。CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性呈剂量依赖性的抑制作用，以及对MMP-9表达和活性的诱导作用，均可能与CSA的肾毒性相关。但这仍需要进一步研究证实。
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