NF-κB及IL-1ra在胃癌中的表达及其意义

　　【摘要】 【目的】 探讨NF-κB及IL-1ra在胃癌中的表达及其意义。 【方法】 通过组织芯片，采用免疫组织化学方法(LSAB法)检测核因子-κB(NF-κB)和抗炎因子白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)在359例胃癌组织中的表达情况。【结果】 NF-κB在伴发淋巴结转移、处于TNM Ⅲ + Ⅳ期、组织学分化较低的胃癌患者中的表达水平分别为80.2%、80.0%、79.2%;IL-1ra在原发灶癌直径 ≤ 3 cm、早期癌、无淋巴结转移和处于TNMⅠ + Ⅱ期的胃癌患者中表达水平分别为61.7%、75.0%、66.4%、61.9%;NF-κB表达阴性的胃癌患者5年生存率高于阳性患者(P = 0.036);伴IL-1ra阳性表达的NF-κB阴性表达患者生存率高于其它组别患者(P = 0.021)。 【结论】 NF-κB的表达水平可以作为胃癌预后不良的指标;IL-1ra可能是延缓胃癌恶性发展的保护因素，但尚需进一步的研究证实。

　　【关键词】 NF-κB; IL-1ra; 组织芯片; 胃癌

　　Expression of NF-κB and IL-1ra in Gastric Cancer and Its Clinical Significance

　　WANG Kang-wei1，2， CAO Qing-hua1， LIN Yuan1， XIAO Ping1， CHE Li-hong1， LUO Can-jiao1， XUE Ling1

　　(1. Department of Pathology， The First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China;

　　2. Department of Pathology， Nansha District Central Hospital of Guangzhou， Guangzhou 511457， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the expression of NF-κB and IL-1ra in gastric cancer， and to explore their correlation with the clinicopathological parameters and prognosis of gastric cancer (GC). 【Methods】 Expression of NF-kB and IL-1ra was detected by immunohistochemistry in tissue microarry of 359 cases of GC. 【Results】 The expression rates of NF-κB in the patients with metastasis of lymph node， TNM III-IV stage， and poorly differentiated of histology were 80.2%， 80.0%， and 79.2%， respectively. The expression rates of IL-1ra in the patients with tumor size ≤ 3 cm， early stage， non-metastasis of lymph node， and TNM I-II stage were 61.7%， 75.0%， 66.4%， and 61.9%， respectively. The 5-year survival rate of the cases with non-expressed NF-κB was statistically higher than that of the cases with expressed NF-κB(P = 0.036). The 5-year survival rate of the patients with negative expression of NF-κB and positive expression of IL-1ra was statistically higher than the others (P = 0.021). 【Conclusions】 NF-κB is the adverse predictors of prognosis of gastric cancer. IL-1ra maybe play a protective role in early gastric cancer stage， but it is necessary to study deeply and get more evidences.

　　Key Words： NF-κB; IL-1ra; tissue microarray; gastric cancer

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：95-99]

　　胃癌是全世界最常见的原发恶性肿瘤，预后差，病死率高。而我国每年约有16万人死于胃癌，居消化系统肿瘤死亡原因的第一位。近年来，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)作为一种具有多向性转录调节作用的蛋白，其与肿瘤的关系得到了重视。已经证实在许多恶性肿瘤中均有NF-κB的高表达[1-3]，其与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡、侵袭和转移等密切相关。同时，多项研究认为，炎症的激发、持续和发展在胃癌的形成过程中起着十分重要的作用。目前发现的最强抑酸剂IL-1β与胃癌发生密切相关[4]，同时也是NF-κB信号转导通路的激活剂[5]，而IL-1ra能竞争性地与IL-1受体结合，进而抑制IL-1的活性，因此，体内IL-1活性在很大程度上取决于NF-κB对其的调控[6]。NF-κB与IL-1ra在胃癌的发生发展中是否存在着某些联系，目前尚不清楚。本文旨在通过用免疫组化方法在组织芯片上检测NF-κB和IL-1ra在胃癌组织中的表达，探讨它们与胃癌生物学特性及发生、发展的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床病例标本的收集和分类标准

　　收集中山大学附属第一医院病理科2001年至2006年手术切除胃癌石蜡包埋标本共359例，所有患者术前均未接受化疗、放疗，且均为初次胃癌手术切除病例，术后均经病理切片检查确诊为胃腺癌。标本的组织学分型和病理学分级均参照2002年WHO胃腺癌组织分类(第2版) 标准进行。临床分期根据胃癌TNM分期进行。

　　1.2 组织芯片制作

　　全部组织均经4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制作成组织芯片，4 ?滋m连续切片。

　　1.3 免疫组织化学染色检测组织芯片中的NF-κB及IL-1ra的表达情况

　　免疫组织化学染色采用LSAB法。NF-κB抗体购自Santa Cruz公司，稀释度为1：200;IL-1ra抗体购自R&D公司，稀释度为1：200;检测试剂盒及DAB购自DAKO公司。切片常规脱蜡水化，EDTA(pH 8.0)微波修复抗原，95 ℃孵育10 min。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性的结肠癌标本作为阳性对照。DAB显色，苏木精对比染色，中性树胶封片。

　　1.4 免疫组织化学记分标准

　　NF-κB阳性产物定位于细胞质，部分细胞核也有着色，以胞质或核内出现淡黄至棕黄色颗粒状物为阳性。IL-1ra阳性产物主要定位于细胞质，呈淡黄色至棕黄色颗粒状。免疫组化阳性反应的分级采用综合阳性细胞所占百分比和着色强度进行判断。具体方法为每张切片随机选取5个高倍视野，尽量避免边缘区，计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞的数目。根据阳性细胞百分比评分为：≤10%为0分，11% ～ 25%为1分，26% ～ 50%为2分，51% ～ 75%为3分，≥76%为4分;着色强度淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两积分相乘，≥2分为阳性反应。阳性程度按积分值分为：0 ～ 1分为阴性(-)，2 ～ 4分为弱阳性(+)，5 ～ 8分为中等阳性(++)，9 ～ 12分为强阳性(+++)。

　　1.5 统计学方法

　　用统计学软件SPSS 11.5对上述实验结果进行分析。计量资料组间比较用ANOVA分析;记数资料组间比较通过χ2检验;生存分析采用Kaplan-Meier分析和Log-Rank检验。

　　2 结 果

　　2.1 胃腺癌组织学分型和分级

　　本组病例包括管状腺癌314例(其中高分化腺癌7例、中分化腺癌91例、低分化腺癌216例)、乳头状腺癌1例、黏液腺癌22例和印戒细胞癌22例。病理分级：G1高分化者(高中分化管状腺癌与乳头状腺癌)99例，G2中低分化者(低分化管状腺癌、黏液腺癌与印戒细胞癌)260例。临床分期根据胃腺癌TNM分期，I期40例，Ⅱ期94例，Ⅲ期188例， Ⅳ期37例。

　　2.2 胃腺癌组织中NF-κB的表达

　　NF-κB的表达主要位于胃腺癌肿瘤细胞的细胞质，偶见于细胞核中(图1)。在359例胃癌中，NF-κB表达阳性病例272例，占75.8%;其中强阳性病例为99例，占27.6%;中等阳性病例为93例，占25.9%;弱阳性病例为80例，占22.3%。在不同组织学类型及不同分化程度的胃腺癌中，NF-κB的表达水平差异有统计学意义;伴发淋巴结转移的胃癌患者NF-κB的表达水平较高;在TNM分期中，NF-κB在中晚期(III + IV)患者中的表达比早期(I + II)患者高。但NF-κB与患者的性别、年龄、癌原发灶大小、病变进程、远处转移等其他因素未发现有明显的相关性(表1)。

　　2.3 胃腺癌组织中IL-1ra的表达

　　IL-1ra的表达主要位于胃腺癌肿瘤细胞的细胞质，偶见于细胞核中(图1)。在359例胃癌中，IL-1ra表达阳性病例175例，占48.7%;其中强阳性病例为48例，占13.4%;中等阳性病例为59例，占16.4%;弱阳性病例为68例，占18.9%。原发癌灶大小、病变进程和是否伴发淋巴结转移与IL-1ra的表达水平有关。原发灶直径 ≤ 3 cm胃癌患者的阳性表达率高于原发灶直径 > 3 cm的患者;进展期患者中IL-1ra的表达水平较高;伴发淋巴结转移的胃癌患者IL-1ra的表达水平较高。但IL-1ra与患者的性别、年龄、远处转移情况和组织学类型分化程度的等其他因素未发现有明显的相关性(表1)。

　　2.4 生存率分析

　　NF-κB阴性表达病例的5年生存率高于NF-κB阳性表达病例(P = 0.036);伴IL-1ra阳性表达的NF-κB阴性表达患者生存率高于所有NF-κB阳性表达患者(P = 0.021);而IL-1ra与NF-κB均阴性表达患者的生存率与NF-κB阳性表达患者组间差异无统计学意义(图2，3)。

　　3 讨 论

　　3.1 胃癌发生学与NF-κB、IL-1ra

　　胃癌的病因和危险因素很复杂，目前认为其是环境和遗传因素综合作用的结果。有关研究表明，在外界刺激包括炎性刺激的作用下，细胞转录水平的过度激活是胃癌的发生过程中的重要环节。关于胃癌的发生模式，Correa等[7]认为是经过慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生、异型增生→胃癌这样一个多阶段过程，该学说获得广泛认同。显然，在上述模式中炎症的激发、持续和发展在胃癌的形成过程中起着十分重要的作用。而细胞因子是炎症中最主要的介质。炎症介质与胃癌的关系成为目前研究的热点之一，其中，与炎症发生、发展密切相关的核因子-κB、白细胞介素-1家族引起国内外学者的高度关注。

　　NF-κB是一类广泛存在于细胞中的具有和某些基因上启动子区固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能性蛋白质，p65是NF-κB活性形式的主要成分。多种细胞外刺激信号可激活NF-κB，如细胞因子IL-1、TNF-α等，其激活机制是一个复杂的过程[8-9]。多项研究表明，NF-κB与乳腺癌、卵巢肿瘤、结肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤的发生关系密切[1-3]。有研究发现，当NF-κB活性被抑制之后，胃癌的发生率明显下降[10]。

　　L-1ra为特异性的IL-1受体拮抗剂，生理情况下主要由单核细胞产生。它不仅是一个急性期反应蛋白，而且在IL-1功能调节方面起着重要作用。研究表明，IL-1是NF-κB激活通路中重要的参与分子， IL-1过表达的转基因小鼠，体内的IL-1通过与IL-1受体结合，激活炎症细胞和胃粘膜上皮细胞内的NF-κB通道，导致炎症和胃癌发生率升高; 而IL-1ra能竞争性地与IL-1受体结合，进而阻断NF-κB的IL-1激活通路，从而抑制炎症和胃癌的发生[5，11]。还有研究表明，在带瘤小鼠身上应用缓释的IL-1ra，可以控制肿瘤的生长[12-13]。

　　3.2 NF-κB、IL-1r表达与胃癌临床病理特征的关系

　　胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，任何年龄均可发生，但多发于中老年，以50 ～ 70岁多见。本组359例胃癌中，发病的男女比例为2.29：1，发病年龄25 ～ 86岁，平均年龄55.5(S = 12.7)岁，这与国内外报道相同。本研究发现， NF-κB的阳性表达与胃癌的淋巴结转移、TNM分期、组织分化程度等病理特征相关，在组织分化程度低和淋巴结转移的胃癌患者中，NF-κB的阳性表达升高，提示其与胃癌的生物学行为密切相关，可能在肿瘤浸润转移中发挥重要作用。这亦与国内外的研究报道相符。IL-1ra的阳性表达与癌原发灶大小、病变进程、淋巴结转移、TNM分期有关，IL-1ra在胃癌发生的早期阶段(癌体较小，浸润较浅，淋巴结尚无转移，临床分期较早)表达较多，随着胃癌病程的发展而逐渐减少，提示其可能作为一种保护因素在胃癌早期起作用。

　　3.3 NF-κB、IL-1r表达与胃癌患者5年生存率的关系

　　据报道，目前胃癌的5年总生存率仅在35% ～ 45%之间，本组统计的5年生存率为51.2%，可能与近年来胃癌早期发现、早期诊断及胃癌切除手术成功率提高有关，同时，回顾性研究时死亡病例失访较多也可能是影响因素之一。本研究在对NF-κB和IL-1ra做胃癌的Log-rank生存分析时发现，NF-κB阳性表达的病例5年总生存率明显低于阴性表达病例(43.9% vs. 63.8%，P = 0.021 < 0.05);伴有IL-1ra阳性表达的NF-κB阴性表达患者的生存率明显高于所有NF-κB阳性表达组，而IL-1ra阴性表达的NF-κB阴性表达患者的生存率与NF-κB阳性表达者组间差异无统计学意义，提示在NF-κB阴性患者组内，IL-1ra阴性表达患者的生存率较IL-1ra阳性表达的患者降低。这说明IL-1ra在胃癌的发生过程中确实存在保护作用，与Tu等[11]在转基因小鼠中的研究结果相似;因此认为产生以上结果的原因，是胃癌患者体内的IL-1ra竞争性地与IL-1受体结合，进而抑制IL-1的活性，抑制了NF-κB的活化，延缓了胃癌的恶性发展。

　　由此，我们认为，炎症介质NF-κB和IL-1ra与胃癌的发生关系密切，NF-κB的表达水平可以作为胃癌预后不良的指标，而IL-1ra则可能是延缓胃癌恶性发展的保护因素。

　　【参考文献】

　　1 Sethi G， Sung B， Aggarwal BB. Nuclear factor-kappaB activation： from bench to bedside [J]. Exp Biol Med (Maywood)， 2008，233(1)：21-31.

　　2 Ng CS， Novick AC， Tannenbaum CS， et al. Mechanisms of immune evasionby renal cell carcinoma： tumor-induced T-lymphocyte apoptosis and NFkappaB suppression [J]. Urology， 2002，59(1)：9-14.

　　3 陈远能，曹 骥，苏建家，等. Rel mRNA和NF-κB2 mRNA在人肝细胞癌中的表达及其临床意义 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2006，27(6S)：677-680.

　　4 Ito H， Kaneko K， Makino R， et al. Interleukin-1beta gene in esophageal， gastric and colorectal carcinomas[J]. Oncol Rep， 2007，18(2)：473-481.

　　5 Leeman JR， Gilmore TD. Alternative splicing in the NF-κB signaling pathway [J]. Gene， 2008，423(2)：97-107.

　　6 Arend WP， Guthridge CJ. Biological role of interleukin 1 receptor antagonist isoforms[J]. Ann Rheum Dis， 2000，59 Suppl 1：i60-64.

　　7 Correa P. Human gastric carcinogenesis： a multistep and multifactorial process —— first american cancer society award lecture on cancer epidemiology and prevention [J]. Cancer Res， 1992，52(24)：6735-6740.

　　8 Senftleben U， Cao Y， Xiao G， et al. Activation by IKKalpha of a second， evolutionary conserved， NF-kappa B signaling pathway [J]. Science， 2001，293(5534)：1495-1499.

　　9 Chun JN， Song IS， Kang DH， et al. A splice variant of the C(2)H(2)-type zinc finger protein， ZNF268s， regulates NF-kappaB activation by TNF-alpha [J]. Mol Cells， 2008，26(2)：175-180.

　　10 Hahm KB， Song YJ， Oh TY， et al. Chemoprevention of Helicobacter pylori-associated gastric carcinogenesis in a mouse model： is it possible?[J] J Biochem Mol Biol， 2003，36(1)：82-94.

　　11 Tu S， Bhagat G， Cui G， et al. Overexpression of interleukin-1β induces gastric inflammation and mobilizes myeloid-derived suppressor cells in mice[J]. Cell， 2008，14(5)：408-419.

　　12 Bar D， Apte RN. A continuous delivery system of IL-1 receptor antagonist reduces angiogenesis and inhibits tumor development [J]. FASEB J， 2004，18(1)：161-163.

　　13 Voronov E， Carmi Y， Apte RN. Role of IL-1-mediated inflammation in tumor angiogenesis [J]. Adv Exp Med Biol， 2007，601(9)：265-270.