别嘌醇治疗中青年高血压病合并高尿酸血症

　　【摘要】 探讨常压高浓度氧对新生大鼠脑细胞凋亡、脑组织MBP(髓鞘碱性蛋白)表达和早期神经行为发育的影响。【方法】 166只7日龄SD大鼠，随机分空气对照组和80%高氧模型组， 新生鼠分别于开始吸氧后24、72 h被处死，TUNEL法观察不同高氧暴露时间大鼠脑组织细胞凋亡指数;高氧暴露72 h组在生后10、15 d，完成神经行为功能测试后，免疫组织化学染色观察脑组织MBP表达，空气组新生鼠处死日龄与高氧组相同。【结果】 高氧2 h组脑细胞凋亡指数较高氧0h组(空气对照组)增加(P < 0.01)，随着吸氧时间的延长，细胞凋亡逐渐增多，以12 ～ 24 h 组细胞凋亡最明显，72 h下降，但仍较0 h组增加(P < 0.01)。 高氧72 h组第10天、第15天MBP的表达较空气组低(137 ± 5 vs. 131 ± 6， 128±5 vs. 122 ± 5)(P < 0.05)。高氧暴露72 h组新生大鼠听觉惊愕、负趋地性、前肢抓握反射、空中翻正的发育在一定日龄较空气对照组延迟(P < 0.05)。【结论】 常压高浓度氧可以引起新生大鼠脑细胞凋亡;抑制脑组织MBP的表达;导致新生大鼠神经行为发育延迟。

　　【关键词】 高氧; 大鼠，新生; 脑细胞凋亡; 神经行为

　　Normobaric Hyperoxia Induced Brain Cell Apoptosis and Delayed EarlyNeurobehavioral Development in Newborn Rats　LI Yi-juan， LIU Mei-na， YU Mu-xue， ZHUANG Si-qi， LIU Yong-dong， CHE Li-hong　1. Department of Pediatrics， 2. Department of Pathology， The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080， China　Abstract： 【Objective】 To evaluate the effects of hyperoxia on the brain cell apoptosis， expression of MBP (Myelin base protein) and the neurobehavioral performance. 【Methods】 A total of 166 7-day-old SD rats were randomly assigned into 2 groups： 80% hyperoxia group and normoxia group. Rat pups were killed in each group on the 24 h， 72 h after the exposure of oxygen for tunnel staining and apoptotic index (AI) was calculated. After exposing to oxygen for 72 h， tests for neurobehavioral toxicity were performed from d10 to d15 and the pups were killed on d10， d15 for MBP stained with immunohistochemical method. Normoxia group was used as normal control. 【Results】 The AI in 2h group was significantly higher than 0h group (normoxia group) (P < 0.01). The AI of hyperoxia group was increased gradually with the prolongation of exposure to 80% oxygen and reached the highest level after exposure to oxygen for 12 ～ 24 h. After exposure to oxygen for 72 h， the AI decreased while still higher than 0 h group (P < 0.01). The expressions of MBP in the brain of hyperoxia group were significantly lower than normoxia groups at d10 and d15 (137 ± 5 vs. 131 ± 6， 128 ± 5 vs. 122 ± 5)(P < 0.05). The positive rates of acoustic startle， forelimb hanging， negative geotaxis， air righting were significantly lower than normoxia group at a certain age (P < 0.05). 【Conclusions】 Normobaric hyperoxia could induce cell apoptosis in the newborn rat. Hyperoxia could decrease the expression of MBP to interfere the myelination of the developing brain. Hyperoxia could delay the neurobehavioral development of newborn rats.

　　Key words： hyperoxia; rat， newborn; brain cell apoptosis; neurobehavior

　　低氧血症是危重新生儿常见的临床表现，严重时可危及生命。氧疗是改善新生儿缺氧状态的重要治疗方法，但是氧气作为一把双刃剑，也可引起众多组织的损伤， 其中肺、眼和脑是最易损伤的脏器。由高氧引起的肺损伤、早产儿视网膜病变已经在动物实验及临床上得到证实，但高浓度氧气对脑(特别是未成熟脑)的影响则还没有清楚的认识[1]，国内外文献报道不多，目前尚未发现有关高氧对正常新生大鼠神经行为发育的影响方面的研究。本研究拟通过制备常压高氧性脑损伤动物模型，探讨常压高浓度氧对正常新生大鼠脑发育的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物与试剂

　　健康Sprague Dawley (SD) 大鼠由中山大学医学动物实验中心提供。细胞凋亡原位检测试剂盒购自德国Calbiochem公司，鼠抗髓鞘碱性蛋白(MBP)购自美国 USBiological公司，S-P超敏试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物技术开发公司。有机玻璃氧箱：自制50 cm × 40 cm × 40 cm。智能测氧仪(YHL型)购自北京航天科技集体公司703所。微量血气分析仪瑞士Abbott i-STAT公司生产。德国Leica RM2135型石蜡切片机，日本Nikon ECLIPSE 50i、Nikon E5400显微镜及自动照相系统，德国KONTRONI BAS2.0版全自动图像分析系统。医用氧气购自广州气体厂。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物模型的制备及分组

　　250 ～ 300 g 左右SD大鼠，雌雄交配(4 ∶ 1)，孕21 ～ 23 d 自然分娩的新生鼠中，取体质量12 ～ 18 g 的7日龄新生鼠(雌雄不限) 166只，随机分为两组：高氧实验组(依高氧暴露时间细分为高氧暴露2 h、6 h、12 h、24 h、72 h组， 其中72 h组 n = 30只，余每小组n = 10)和空气对照组(各时间点新生鼠数目与高氧组相同)。参照Felderhoff-Mueser U的方法[2]， 高氧组置于氧箱(有机玻璃箱)中持续输入氧气，氧体积分数维持在(80.0 ± 5.0)%， 每日用数字式测氧仪监测(北京航天科技集团公司)，用钙石灰吸收CO2，使其体积分数小于0.5%。温度25 ～ 26 ℃，湿度60.0% ～ 70.0%，每天开箱1 h，喂水及饲料，更换垫料，与空气组互换母鼠以避免母鼠因氧中毒而影响哺乳。空气组置于同一室内空气中，氧体积分数21.0%，饲养条件与高氧组相同。

　　1.2.2 标本的获取与预处理

　　①新生鼠动脉血气分析：取15d健康新生鼠6只，分空气对照组及高氧组。给高氧组新生鼠持续吸入体积分数80%氧3 min，乙醚麻醉后继续吸氧情况下，开胸经左心室穿刺取血约0.5 mL，用Abbott i-STAT微量血气分析仪进行分析。空气组取血方法同前。②脑组织含水量的测定：空气/高氧开始暴露后72 h各处死10只大鼠，开颅取脑，切除小脑和后脑(包括小脑和脑干)，置70 ℃干燥箱充分脱水，再称取干质量，计算出脑含水量。③高氧组各时间点新生鼠分别与开始吸氧后24、72 h 时被处死。空气组动物处死日龄与高氧组相同。各组大鼠100 g/L水合氯醛300 mg/kg经腹腔注射深度麻醉下，开胸经左心室至升主动脉依次灌注磷酸盐缓冲溶液(4 ℃，pH7.4)和40 g/L多聚甲醛(4 ℃，pH7.4)。灌注固定后，去掉颅盖骨，取全脑标本，参照Paxinos-Waston图谱取前囟后0.5 ～ 1 mm脑组织后固定12 h 后，进行常规脱水、石蜡包埋，连续冠状5 μm厚切片，行脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)法染色检测细胞凋亡情况。④空气/高氧暴露72 h 组新生鼠生后10 ～ 15 d(每组20只)分别行有关的神经行为检测，检测结束后，每时间点每组各处死动物10只，取大脑标本(方法同上)分别行免疫组织化学染色测定脑组织髓鞘碱性蛋白(mye lin basic proteir，MBP)的表达。

　　1.2.3 各指标检测方法及计算

　　①脑含水量计算：脑含水量 = (湿质量-干质量)/湿质量 × 100%。②石蜡切片细胞凋亡检测：采用TUNEL法，细胞核出现棕黄色染色为阳性。400倍光镜下随机选择5个视野(其中脑灰质2个、白质2个、海马1个)并计数1 000个细胞，记录凋亡细胞数，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。AI = (凋亡细胞数/1 000) × 100%。③MBP表达测定：采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP法)。一抗MBP浓度1：100。以细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。MBP蛋白表达半定量测定：每组选择染色清楚的切片5张，400倍光镜下随机选取9个不重复视野(胼胝体、外囊、纹状体各3个)，固定窗口面积，利用KONTRONI BAS 2.0版全自动图像分析系统，计算其灰度值，平均灰度值越低，说明蛋白表达信号越强。④神经行为学检测：10 ～ 5 d时单盲法进行。通过新生大鼠特有的神经反射进行评定[3-4]。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS11.0软件进行处理， 计量资料以均数 ± 标准差(x ± s) 表示，各组间比较采用单因素方差分析;分类资料以百分率表示，组间阳性率比较采用卡方检验。检验水准α = 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 高氧对新生大鼠一般状态的影响

　　新生大鼠在吸氧过程中及吸氧72 h后均未出现惊厥、瘫痪等异常行为。空气组活泼好动、反应灵敏;高氧模型组部分动物于吸氧后第1天表现精神不振、懒动、肌张力低，停吸氧后2 ～ 3 d后逐渐恢复正常。

　　2.2 高氧对新生大鼠动脉血氧分压的影响

　　空气组平均PaO2为(87.0 ± 2.7)mmHg，而高氧组为(219.0 ± 10.7) mmHg，高氧组明显高于空气组(P < 0.05)。

　　2.3 高氧对新生大鼠脑含水量的变化

　　高氧组动物脑含水量为(87.6 ± 4.3)%，空气组为(86.5 ± 8.3)%，两组脑含水量有显著性差异(P < 0.05)。

　　2.4 脑组织细胞凋亡检测

　　高氧2 h组脑细胞凋亡指数较高氧0 h组(空气对照组)增加(P < 0.01，每时间点动物n = 10)，随着吸氧时间的延长，细胞凋亡逐渐增多，以12 ～ 24 h 组细胞凋亡最明显，72 h下降，但仍较0 h组增加(P < 0.01，图1)。

　　2.5 脑组织MBP表达

　　高氧组各时间点MBP的表达较空气组低(P < 0.05)，差异有统计学意义(图2A-H，表1)。

　　2.6 早期神经行为评价

　　两组新生大鼠游泳运动、向亲性行为的阳性率无统计学意义(P > 0.05)。高氧组新生大鼠10 ～ 12 d听觉惊愕的阳性率较空气对照组低(P < 0.05);11 ～ 12 d前肢抓握的阳性率较空气对照组低(P < 0.05); 13 ～ 14 d空中翻正的阳性率较空气对照组低(P < 0.05，表2)。高氧组生后10 ～ 13 d负趋地性所需时间较对照组明显延长(P < 0.05)， 生后14 ～ 15 d负趋地性所需时间虽然仍比对照组延长，但差异无统计学意义(P > 0.05，图3)。

　　3 讨 论

　　据报道诸多动物中只有新生猕猴和未成熟大鼠在神经解剖方面与人类最为接近。7日龄SD大鼠处在脑生长突增期，与人类妊娠中后期及生后3年内的脑发育相类似[5]， 故本研究参照Felderhoff-Mueser的方法[2]，利用7日龄的SD大鼠建立高氧性脑损伤模型，通过比较高氧组及空气对照组两组动物脑组织的病理改变以及神经行为发育的影响，探讨高浓度吸氧对新生大鼠脑近期结构和功能的影响。

　　本研究结果显示高氧组动物脑组织含水量增加，早期脑组织出现脑水肿， 可以解释吸氧后动物出现一过性的精神不振、懒动、肌张力低;同时，高氧组动脉血氧分压水平明显高于空气组。根据文献报道动脉血氧分压与脑组织氧分压成正相关，高浓度氧可引起脑组织氧分压明显升高[6-7]， 脑组织高氧分压可引起早产儿脑血管收缩，脑血流量减少[8]，从而减少过多的氧进入脑组织，这一防御功能存在致脑缺血的危险性， 特别是新生鼠脑血管可以持续收缩，当再回到空气中时，则脑组织处于缺血状态，可以造成继发性脑缺氧缺血损伤;而长时间高氧可引起大脑微血管闭塞，影响中枢神经系统预后[9]，由此说明高氧对脑血管的影响是其引起脑损伤的原因之一。

　　3.1 常压高浓度氧诱导未成熟脑细胞凋亡

　　本研究结果显示，细胞凋亡与高氧暴露时间具有密切关系，随着高氧暴露时间的延长，脑细胞凋亡的数目增加，与Felderhoff-Mueser的研究结果相似[2]。有文献报道神经元、少突胶质前体细胞、未成熟的少突胶质细胞[10]、大脑毛细血管内皮细胞[9]等对高氧具有易感性，考虑与其增殖速度有关。处在脑生长突增期的脑细胞的过度凋亡可以影响未成熟脑发育的轨迹，包括神经细胞增殖与分化、神经细胞移行与分化、神经组织过程、成髓鞘过程[11]，可能引起与脑组织病理改变不相符合的严重后遗症。

　　3.2 常压高浓度氧抑制脑组织MBP的表达

　　MBP是少突胶质细胞的标志性蛋白，髓鞘蛋白表达下降反映了少突胶质细胞数量和功能的下降。MBP检测是评价未成熟脑组织成髓鞘过程的重要指标[12]，同时也是反映CNS 实质性损害、特别是髓鞘脱失变化较特异敏感的指标。Sedowofia K[12]发现血氧浓度的波动可以使下丘脑MBP的表达下降70%，而本研究结果显示，高氧组脑组织中MBP表达下降，以外囊、纹状体及皮层最为明显，说明单纯高浓度氧可以抑制MBP的表达，但程度较血氧波动引起者轻。高氧引起少突胶质细胞损伤和髓鞘化过程障碍这一病理改变可能是高氧致神经损伤的基础。高氧引起脑组织MBP免疫染色丢失的机制考虑与少突胶质前体细胞过度死亡等有关[9]。

　　3.3 常压高浓度氧致新生大鼠早期神经行为异常

　　神经行为是机体的感觉、运动、认知与记忆能力等综合表现，是反映中枢神经系统功能发育状况的重要手段，也是评价外来有害因素影响中枢神经系统发育并导致行为异常的有效指标。神经行为毒理学研究方法由于它的敏感、可定量及可测定外来化合物导致的亚临床表现，已成为评价化学物质安全性的重要方法[13-14]。

　　本研究利用毒理学和神经发育行为学方法观察高氧对新生大鼠多项神经行为发育的影响，研究高氧对新生大鼠神经系统发育的影响。本研究中新生大鼠高氧暴露后，运动发育和协调活动的指标如空中翻正、感觉发育如听觉惊愕及新生的反射活动如负趋地性等指标在高氧组一定的日龄中迟缓于空气组，表明高氧可引起新生大鼠脑功能发育的延迟， 在脑的正常“组织”过程中， 高氧对细胞群体中的特殊联系的建立、神经元之间的联系及凋亡、已建立的神经组织的功能发育等方面有一定破坏作用。本实验发现高氧对少突胶质细胞功能蛋白MBP有明显抑制作用，由此推测脑组织成髓鞘过程障碍可能在高氧后神经行为异常中起重要作用。而高浓度吸氧对新生鼠脑长期结构和功能的影响有待做进一步的研究。

　　以上研究结果提示高浓度氧可以引起新生大鼠脑细胞的凋亡，影响脑组织MBP表达，引起近期神经行为异常。我们应深入研究高氧对未成熟脑发育轨迹的影响及其可能的分子机制，减少氧疗相关脑损伤提供必要理论依据及干预措施。

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