抵抗素对Ｃ２Ｃ１２肌细胞株葡萄糖代谢的影响

　　【摘要】 抵抗素(resistin)是一种与胰岛素抵抗(IR)密切相关的脂肪细胞因子。本研究通过观察resistin对C2C12肌细胞株葡萄糖代谢的影响，以探讨resistin在骨骼肌IR发生中的作用。【方法】构建含resistin基因的重组表达质粒pcDNA3.1-resistin，用于转染C2C12肌细胞株，使其表达resistin，用3H-2-脱氧葡萄糖进行葡萄糖摄取试验，用D-[14C(U)]葡萄糖进行葡萄糖氧化和糖原合成试验，RT-PCR检测肌细胞的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRMA。 【结果】 pcDNA3.1-resistin转染的C2C12肌细胞株可表达resistin;resistin使肌细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取率减少约30%，并使GLUT4mRNA 表达降低28%，而对葡萄糖氧化和糖原合成无显著影响。 【结论】 resistin可能通过抑制骨骼肌GLUT4mRNA的表达而降低葡萄糖摄取，但对葡萄糖氧化和糖原合成影响较小，提示resistin在骨骼肌IR发生中的作用有限。

　　【关键词】 抵抗素; 葡萄糖代谢; 肌细胞

　　Effects of Resistin on Glucose Metabolism in C2C12 Myocytes　LI Fang-ping， LI Zhi-zhen， ZHANG Miao， FU Yu-ru， YAN Li， FU Zu-zhi　Department of Endocrinology， The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China　Abstract： 【Objective】 Resistin is an adipokine highly related to insulin resistance (IR). Our study was to investigate how resistin influences skeletal glucose metabolism， and that the roles of resistin in the pathogenesis of skeletal IR. 【Methods】 The recombinant plasmids PcDNA3.1 expressing resistin were constructed and then transfected into C2C12 myocytes. The expression of resistin in C2C12 myocytes was detected by Western blot. Glucose uptake was measured by 3H-labeled glucose， glucose oxidation and glycogen synthesis were detected with 14C-labeled glucose. GLUT4 mRNA was measured by RT-PCR. 【Results】 Resistin was expressed in transfected myocytes. Resistin decreased insulin stimulated glucose uptake rate about 30% and inhibited the expression of GLUT4 mRNA about 28%. However， there were no significant differences in glucose oxidation and glycogen synthesis. 【Conclusions】 Resistin inhibited insulin stimulated glucose uptake in myocytes by downregulating the expression of GLUT4， and it had no effects on glucose oxidation and glycogen synthesis. The roles of resistin in the pathogenesis of skeletal IR may be a little.

　　Key words： resistin; glucose metabolism; myocytes

　　抵抗素(resistin)是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)密切相关的脂肪细胞因子。研究发现resistin影响机体的葡萄糖代谢，如给C57BL/6J小鼠腹腔注射纯化重组resistin后，小鼠血糖较对照组升高28%;resistin 可使3T3-L1脂肪细胞胰岛素介导的葡萄糖摄取率降低37%[1]。骨骼肌是机体葡萄糖代谢最主要的组织，如骨骼肌对胰岛素的敏感性降低将导致机体IR的发生[2]。既然resistin影响机体的葡萄糖代谢， 那么resistin如何影响骨骼肌的葡萄糖代谢，值得深入探讨。resistin基因在骨骼肌无表达[1]，本研究拟用载有resistin基因的重组真核表达质粒，转染成肌细胞株C2C12肌细胞，使肌细胞表达resistin，观察resistin对肌细胞的葡萄糖代谢的影响，旨在探讨resistin在骨骼肌IR发生中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料和试剂

　　THERMOSCRIPTTM RT-PCR System购自Gibcobrl公司;pGEM-T Vector system I购自Promega 公司;pcDNA3.1购自 Invitrogen公司;SuperFect Transfection Reagent 购自QIAGEN公司; C2C12成肌细胞购自ATCC，CRL-1772;豚鼠抗小鼠resistin抗体(一抗，guinea pig anti-mouse resistin，Linco公司)，辣根过氧化物酶结合的抗豚鼠IgG(H + L)购自晶美公司; 3-异丁基1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine)，细胞松弛素B(cytochalasin B)和氢氧化海胺(benzethonium hydroxide)购自Sigma公司短效胰岛素(humulin R)购自美国礼来公司;3H-2-脱氧葡萄糖(放射性比活度5.4Ci/mmol)购自中国同位素总公司;D-[14C(U)]葡萄糖(放射性比活度250 ～ 360 m Ci/mmol，购自NEC公司。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 重组真核表达质粒pcDNA3.1-resistin构建

　　根据小鼠resistin 基因mRNA序列，设计扩增resistin 基因mRNA编码区序列的特异引物，上游引物：5′-CGGAATTCATGAAGAACCTTTCATTTCC -3′(下划线的部分为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物：5′-CTAGTCTAGATCAGGAAGCGACCTGCAGCT -3′(下划线的部分为XbaⅠ酶切位点)。按TRIzol Reagent操作说明抽提小鼠脂肪组织总RNA，用RT-PCR System优化反应条件合成resistin cDNA，并克隆于pGEM-T载体 ，行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，resistin cDNA再亚克隆pcDNA3.1，构建的重组真核表达质粒送测序鉴定。

　　1.2.2 转染和鉴定

　　按SuperFect Transfection Reagent说明进行操作，通过脂质体将pcDNA3.1-resistin转染C2C12肌细胞株，并用含终浓度为500 μg/mL G418培养液筛选转染阳性细胞克隆。Western blot方法鉴定被转染的C2C12肌细胞株resistin蛋白质的表达。

　　1.2.3 细胞分组

　　对照组(未转染)、瞬时组(瞬时转染pcDNA3.1-resistin)、载体组(瞬时转染pcDNA3.1)和稳定组(稳定转染pcDNA3.1-resistin)。瞬时转染后3 h，将含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养液培养，换为含50 mL/L马血清的高糖DMEM培养液诱导C2C12成肌细胞分化为出肌小管，在倒置显微镜下观察诱导分化情况，当在镜下见90%的细胞融合形成条索状， 刮取细胞送电镜鉴定。

　　1.2.4 葡萄糖代谢的检测

　　4组细胞按不加胰岛素或加100 nmol/L短效胰岛素又分为细胞基础状态(base)或胰岛素刺激状态(insulin) 2个亚组，每种试验条件均重复6次，液体闪烁计数器(LS3801，Beckman，USA)检测样品的放射活性。①葡萄糖摄取的测定：细胞以5 × 105接种于6孔板中，培养至60%融合，换用无血清5.5 mmol/L葡萄糖的MEM培养液，以使细胞处在无血清和低糖的饥饿状态。每孔加入37 kBq[3H]脱氧葡萄糖，在室温下放置10 min。每孔立即加入10 ?滋L浓度为0.48 mg/mL细胞松弛素B(终浓度为10 ?滋mol/L)，以终止葡萄糖摄取。细胞用冰冷的PBS冲洗2次，每孔加入0.5 g/L氢氧化钠0.2 mL，在室温放置20 min，使细胞裂解。吸全部溶液点于层析纸上，液烁计数检测。②葡萄糖氧化代谢的测定：细胞以2 × 105接种于接种于12孔板中，培养至60%融合，换用无血清5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养液，以使细胞饥饿3 h。每孔加入含0.1 ?滋Ci/mL D-[U-14C]葡萄糖，无血清、无抗生素含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM 1 mL，每孔盖上1张浸有氢氧化海胺的半干层析纸，盖上培养板盖子培养2 h。每孔加700 mL/L高氯酸0.2 mL终止反应，37 ℃摇荡1 h，以让层析纸充分吸收氧化产生的CO2。层析纸滤纸干燥后，液烁计数检测。③糖原合成的测定：细胞以1 × 105接种于24孔板中，换用无血清5.5 mmol/L葡萄糖的MEM培养液，以使细胞饥饿18 h。细胞用PBS洗2次后，加入含18.5 kBq/mL D-[U-14C]葡萄糖，每孔加入300 g/L氢氧化钾0.1 mL，于95 ℃水浴中加热30 min，充分裂解细胞。将所用溶液点于层析纸上，液烁计数检测。

　　1.2.5 检测GLUT4mRNA

　　按TRIzol Reagent操作说明抽提C2C12总RNA。按THERMOSCRIPTTM RT-PCR System操作说明，在优化的条件下进行RT-PCR，GLUT4上游引物：5′-GCCCGAAAGAGT CTAAAGCG-3′，下游引物：5′- ACTAAGAGCACCG AGACCAA-3′，PCR产物长度为312 bp。β-actin 上游引物：5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，下游引物：5′-ATCGTGGGCCGCTCTAGGCACC-3′， PCR产物长度为542 bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外光透射下摄像。应用图像分析系统(KONTRON IBAS2.0， Germany)分析，以GLUT4 mRNA/β-actin mRNA灰度值作为GLUT4mRNA表达的相对量。

　　1.2.6 数据处理和分析

　　葡萄糖摄取的量是根据3H-2-脱氧葡萄糖放射性比活度及所测的dpm值换算，以每10 min 106细胞葡萄糖摄取的pmol数表示(pmol·10-6细胞·10 min-1)，6孔板每孔细胞数以2 × 106计算，细胞的葡萄糖摄取即为测得的dpm/(2.0 × 1011 Bq/mmol × 细胞数)。细胞葡萄糖氧化或糖原合成的量是根据D-[U-14C]葡萄糖放射性比活度及所测的dpm值换算，以每小时106细胞葡萄糖氧合或糖原合成的pmol数表示(pmol·h-1·10-6细胞)， 12 孔板每孔细胞数以1 × 106计算，24孔板每孔细胞数以5 × 105计算，葡萄糖氧化或糖原合成的量即为测得的dpm/(1.13 × 1010 Bq/mmol × 细胞数)。数据以均数 ± 标准差表示，组间比较用方差分析，采用SPSS 11.0统计软件分析，显著性水准为小于0.05。

　　2 结 果

　　2.1 重组真核表达质粒pcDNA3.1-resistin构建

　　RT-PCR产物凝胶电泳图见位于250 bp与500 bp之间有一条带，与欲扩增resistin cDNA理论长度363 bp相符(图1)。重组质粒pGEM-T-resistin 酶切图示PCR产物resistin cDNA成功插入pGEM-T(图2)。核苷酸序列分析结果显示：插入pcDNA3.1的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因 mRNA编码区序列一致，表明已成功构建载有小鼠resistin基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-resistin。

　　2.2 细胞分化的判断

　　C2C12成肌细胞诱导分化第6天，在倒置显微镜下见90%以上细胞融合成条索状(图3A)，电镜下见细胞内有肌小管(图3B)。

　　2.3 Western blot检测

　　瞬时组和稳定组的细胞有resistin蛋白的表达，对照组和载体组的细胞无resistin蛋白的表达，表明pcDNA3.1-resistin已成功转染瞬时组和稳定组的细胞，并能表达resistin蛋白(图4)。

　　2.4 葡萄糖代谢的检测

　　2.4.1 葡萄糖摄取的检测

　　对照组、瞬时组、载体组和稳定组4组间，细胞基础状态的葡萄糖摄取无显著性差别(P > 0.05)，而胰岛素刺激的葡萄糖摄取有显著性差别(P < 0.05)， resistin使C2C12肌细胞株胰岛素刺激的葡萄糖摄取减少约30%(表1)。

　　2.4.2 葡萄糖氧化的检测

　　4组细胞，基础状态和胰岛素刺激的葡萄糖氧化差别均无显著性(P > 0.05，表1)。

　　2.4.3 糖原合成的检测

　　4组间细胞基础状态和胰岛素刺激的糖原合成差别均无显著性(P > 0.05，表1)。

　　2.5 resistin对C2C12肌细胞株GLUT4mRNA的影响

　　对照组、瞬时组、载体组和稳定组C2C12肌细胞株GLUT4mRNA 表达的相对量分别是0.73 ± 0.11、0.53 ± 0.16、0.69 ± 0.08和0.49 ± 0.09(P = 0.041，n = 3)， resistin使C2C12肌细胞株GLUT4 mRNA 表达降低28%(图5)。

　　3 讨 论

　　C2C12成肌细胞属小鼠肌母细胞系，诱导分化形成肌小管，常用作为研究骨骼肌功能的细胞模型。本研究通过用含50 mL/L马血清的DMEM培养基成功诱导C2C12成肌细胞分化为肌小管(图3)。

　　进行本研究时尚未有商品化的小鼠resistin蛋白质购买，为探讨resistin对小鼠C2C12肌细胞株葡萄糖代谢的影响，本研究用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增resistin 基因cDNA，构建载有小鼠resistin基因的重组真核表达质粒，通过脂质体将pcDNA3.1-resistin转染C2C12肌细胞株，使本身不表达resistin基因的C2C12肌细胞株表达resistin蛋白质(图4)。由于在瞬时转染中重组质粒导入细胞以获得目的基因暂时但高水平的表达，最好在转染后1 ～ 4 d内检测目的基因的表达。C2C12细胞需诱导6 d才能分化出肌小管，本研究为避免瞬时转染细胞表达resistin基因高峰期已过，而通过G418筛选稳定转染株。

　　本研究葡萄糖摄取实验resistin使瞬时和稳定转染的细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取显著低于对照组和载体组的的细胞，说明resistin抑制C2C12肌细胞株胰岛素刺激的葡萄糖摄取。这与Moon等[3]的研究结果相似，其用不同剂量的重组resistin(0 ～ 500 nmol/L)孵育L6大鼠骨骼肌细胞，发现100 nmol/L和500 nmol/L的resistin 可完全抑制细胞胰岛素介导的葡萄糖摄取，10 nmol/L和50 nnmol/L可使细胞基础的葡萄糖摄取降低10% ～ 14%。用载有小鼠resistin基因的质粒稳定转染L6大鼠骨骼肌细胞后，细胞基础状态和胰岛素刺激的葡萄糖摄取均明显受抑制。Fan[4]的研究也得出了类似的结果。

　　resistin是通过什么途径抑制C2C12肌细胞株胰岛素刺激的葡萄糖摄取?本研究发现resistin使C2C12肌细胞株GLUT4mRNA 表达减少28%。 Palanivel 等[5]研究发现 resistin使GLUT4转移到L6大鼠骨骼肌细胞表面的数量减少，从而抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取。而Moon的研究发现， resistin抑制L6细胞葡萄糖摄取，不是通过影响GLUT4转位到浆膜的数量，而是使转位到浆膜的GLUT4功能减弱所致。可见，resistin使肌细胞葡萄糖摄取率降低与GLUT4有密切的关系。

　　本研究发现resistin对基础状态和胰岛素刺激的葡萄糖氧化及糖原合成均无明显影响。Pravenec等[6]研究发现resistin可通过抑制三羧酸循环而减少葡萄糖的氧化，抑制糖原合成激酶3?茁磷酸化而减少胰岛素介导的糖原合成。Dietze等[7]将人的骨骼肌细胞与人的脂肪细胞共培养，发现脂肪细胞分泌的细胞因子导致骨骼肌细胞的IR， 但resistin在骨骼肌细胞表面的量极低，推测 resistin可能没有参与骨骼肌细胞IR的发生。有研究显示resistin导致机体糖代谢异常主要是通过使肝脏糖异生增强，从而肝糖输出增多所致[8-9]。

　　本研究的结果显示，resistin对骨骼肌葡萄糖代谢的影响，可能仅通过抑制细胞GLUT4的表达，使 GLUT4数量减少，从而抑制细胞的葡萄糖摄取，但不影响细胞葡萄糖氧化和糖原合成，而这些是细胞内葡萄糖利用主要环节，resistin在骨骼肌IR发生中的作用是有限的。总之，resistin 对细胞糖代影响非常复杂，目前研究结论不尽一致[10-11]。

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