解脲脲原体ｅｒｍＢ基因与转座子遗传标记ｉｎｔ-Ｔｎ的相关性

　　【摘要】 探讨解脲脲原体(Uu)临床株ermB耐药基因与接合转座子遗传标记int-Tn基因之间的关系。 【方法】 采用微量肉汤稀释法体外测定76株Uu对红霉素的最低抑菌浓度(MIC)，设计引物扩增ermB和int-Tn基因。 【结果】 Uu对红霉素MIC范围为 ≤ 0.125 ～ ≥ 128 μg/mL，MIC50为32 μg/mL，MIC90 ≥ 128 μg/mL，耐药率为78.95%。共21株Uu菌株检测到ermB基因，其中19株的MIC ≥ 8 μg/mL，2株的MIC = 4 μg/mL。21株Uu携带int-Tn基因，ermB基因与int-Tn基因之间有显著相关性。 【结论】 ermB基因可能是介导Uu对红霉素耐药的一种重要的基因，ermB与转座子遗传标记int-Tn基因密切相关。

　　【关键词】 解脲脲原体; 红霉素; ermB基因; 转座子

　　Association between ermB Gene and Genetic Marker ofTransposon int-Tn in Ureaplasma Urealyticum　LU Chun， YE Ting-lu， ZHU Guo-xing， CHEN Chuan-jie， LU Rong-biao1. Department of Dermato-venereology， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China;2. Guangdong Provincial Centre for Skin Disease and STD Control， Guangzhou 510500， China　Abstract： 【Objective】 To study the association between ermB gene and int-Tn gene， a genetic marker of transposon in Ureaplasma urealyticum (Uu) clinical isolates. 【Methods】 We detected the minimum inhibitory concentrations (MICs) to erythromycin by broth dilution method in 76 clinical strains of Uu. Polymerase chain reaction was used to detect the ermB and int-Tn genes. 【Results】 The MICs， MIC50， MIC90 of Uu to erythromycin were ≤ 0.125 ～ ≥ 128 μg/mL， 32 μg/mL， and ≥ 128 μg/mL， respectively， with a high resistance rate of 78.95% (60/76). The ermB gene was detected in 19 strains with MIC ≥ 8 μg/mL and 2 strains with MIC = 4 μg/mL of Uu. int-Tn gene was detected in 21 strains of Uu. ermB gene was strongly associated with int-Tn gene analyzed by chi-square test. 【Conclusion】 ermB gene may be one of the important genes conferring resistance to erythromycin in Uu， and it is strongly associated with int-Tn gene in Uu.

　　Key words： Ureaplasma urealyticum; Erythromycin; ermB Gene; transposon

　　非淋菌性尿道炎和黏液脓性宫颈炎是目前最常见的性传播疾病之一，解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)与这两种疾病的发生密切相关，是目前性病防治工作热点病原体之一[1]。近年来文献报道Uu对大环内酯类耐药率已相当高[2]，给防治工作带来诸多困难。Uu对大环内酯类的耐药机制及相关的分子基础至今尚未完全清楚。研究提示Uu 23s RNA的点突变可以产生与细菌类似的对大环内酯类耐药[3]，但迄今未见其他耐药机制研究的报道。因此，开展这方面的研究对监测Uu耐药状况、指导临床治疗、加深对Uu耐药机制的认识以及探讨耐药机制的来源与传播，均有重要意义。ermB基因是介导对大环内酯类耐药的一种重要基因，其可能定位于转座子。我们检测临床分离的76株解脲脲原体ermB及int-Tn基因，并分析两者之间的关系，现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　研究共收集76株Uu临床标本，均为2008年3月至5月期间在我科门诊就诊的尿道炎、宫颈炎患者或健康体检者的尿道或宫颈分泌物标本。Uu-3血清型标准株ATCC27815、Uu-8血清型标准株ATCC21618为本实验标准对照。

　　1.2 主要试剂

　　Uu液体培养基购自广州市怡林园生物工程有限公司，批号09050601。A7固体鉴定培养基购自法国梅里埃公司，批号784094601。红霉素标准品购自美国Sigma公司，批号2040401，实验前先用少量无水乙醇溶解，再用液体培养基将其稀释为512 ?滋g/mL。PCR反应试剂盒及DNA marker购自天根生化科技(北京)有限公司;DNA引物由美国Invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司合成。琼脂糖购自广州威佳科技有限公司。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 解脲脲原体的分离、纯化及鉴定

　　Uu标本以标准的方法收集后[4]，用A7固体培养基鉴定，待于低倍镜下观察有典型棕黑色海胆状细小菌落为Uu生长。挑取单个典型菌落重复接种于液体培养基增菌，增菌后菌液置于-20 ℃冰箱备用。

　　1.3.2 MIC的测定

　　采用微量肉汤稀释法进行[4]。红霉素的浓度范围为0.125 ～ 128 μg/mL。耐药结果的判断参考文献，即≥8 μg/mL为耐药，<8 μg/mL为敏感[4]。

　　1.3.3 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳

　　菌株DNA提取参考文献[5]。PCR反应体系均为：20 μmol/L引物各1 μL，2.5 U/μL Taq酶0.5 μL，10 × PCR Buffer (含Mg2+) 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 36.5 μL，总反应体积50 μL。ermB基因引物：上游5′-GCAAATGGTGTA GGTAAGACAACT-3′，下游5′-ATCATGTGATGT AAACAAAAT-3′[6]，反应条件：94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环;int-Tn基因引物：上游5′-GCGTGATTGTATCTCACT-3′，下游5′-GACGCTCCTGTTGCTTCT-3′[7]，反应条件： 94 ℃变性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中ermB基因为639 bp，int-Tn基因为1 046 bp。将PCR产物直接送Invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司纯化测序，测序结果在Blast (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上比对证实。

　　1.4 统计学处理

　　ermB基因与int-Tn基因相关性分析采用卡方检验，双侧检验，显著性水准α = 0.05。所有数据均由The SAS System for Windows V8软件处理。

　　2 结 果

　　2.1 MIC结果

　　76 株Uu临床株中，MIC范围是 ≤ 0.125 ～ ≥ 128 μg/mL， MIC50为32 μg/mL，MIC90 ≥ 128 μg/mL。其中检测出60株耐药株，耐药率为78.95%。Uu血清型3、8标准株MIC分别为0.5、2 μg/mL。

　　2.2 ermB和int-Tn基因的PCR检测

　　图1、2分别为Uu ermB基因和int-Tn基因的PCR电泳图。PCR产物测序、比对证实均为两基因。检测到ermB基因、int-Tn基因阳性Uu均为 21株，阳性率均为28.38%。

　　2.3 ermB和int-Tn基因与耐药程度的关系

　　ermB阳性的21株Uu中，19株(90.48%)分布在对红霉素的MIC ≥ 8 μg/mL的Uu中，2株(9.52%) MIC为 4 μg/mL的Uu菌株，经多次PCR检测均发现其ermB基因阳性。21株携带int-Tn基因的Uu中，16株(90.48%)MIC ≥ 8 μg/mL，5株的MIC ≤ 4 μg/mL(表1)。

　　2.4 ermB与int-Tn基因的相关性

　　分析ermB基因与int-Tn基因之间的相关性发现，21株ermB基因阳性的Uu中，15株(71.43%)同时携带int-Tn基因，而21株int-Tn基因阳性Uu中，也有15株(71.43%)同时携带ermB基因。χ2检验分析发现两基因之间呈正相关性(表2;χ2 = 27.84， P < 0.001，相关系数r = 0.4679)。

　　3 讨 论

　　我们发现广州地区Uu临床株对红霉素的耐药率为78.95%，耐药形势也不容乐观，红霉素已不适合作为本地区的一线治疗药物。同时，除了继续加强对Uu对各种治疗药物的耐药性的监测及规范临床用药外，开展对Uu对大环内酯类耐药分子机制的研究也迫在眉睫。

　　目前有关Uu对大环内酯类耐药机制研究报道很少。在细菌，大环内酯类耐药的可能机制有药物靶位点改变、抗菌素灭活酶的产生、药物主动外排三种，而红霉素核糖体甲基化酶基因(erythromycin ribosome methylase，erm)介导的甲基化作用是一种十分常见的耐药机制[8]。erm基因目前已发现有A、B、C等多种亚型，编码产物能以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，催化23SrRNA的单个腺嘌呤成为甲基或二甲基-腺嘌呤，从而影响23SrRNA中大环内酯类药物结合的空间结构，可引起对大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素B型耐药(MSLB表型)。ermB基因介导的耐药水平范围较大，且介导的耐药水平与不同的菌属有关[9-10]。我们研究在Uu临床株中也发现了ermB基因，提示Uu对大环内酯类药物耐药机制与细菌也有一定的相似性，但相当部分菌株未发现该耐药基因，提示还可能存在其它的耐药机制。我们发现携带ermB基因的菌株中，90%出现在对红霉素的MIC ≥ 8 μg/mL的菌株中，但有2株MIC = 4 μg/mL，提示ermB基因在不同的微生物中可能介导不同的耐药水平。

　　研究提示，在多种细菌中ermB基因定位于转座子内(transposon， Tn)[11-12]。转座子是除了携带与移动作用有关的基因外，还携带有其他基因(如耐药基因)的一段可移动DNA 序列。可分为复合型转座子、Tn3 族转座子和接合型转座子。int-Tn基因是接合转座子Tn1545 及Tn916的整合酶基因，编码转座子整合到新位点所必需的整合酶， 是这些转座子的遗传标记[13]。国外研究发现，67%无乳链球菌携带int-Tn基因，国内学者也发现int-Tn基因在肺炎链球菌的阳性率为87.6%[9，14]，提示转座子普遍存在于细菌。通过分析ermB与int-Tn基因的相关性，可以推测ermB基因是否定位与转座子内[12-13]。我们的研究发现28.38%的Uu携带int-Tn基因，提示在Uu中，携带转座子也是比较多见的。分析Uu的int?鄄Tn与ermB基因相关性发现两者之间呈正相关，即ermB基因阳性的菌株，其int-Tn基因也倾向于阳性，提示在Uu，ermB基因也可能定位于转座子。但部分ermB基因阳性菌株未发现转座子，提示在Uu ermB基因还可能有其它的基因宿主。

　　在革兰阳性细菌中，转座子可在细菌不同种、属间进行接合转座，整合到受体染色体或质粒的不同位点上使抗生素的耐药得以扩散[12]。Uu寄生于尿道、阴道、宫颈等下生殖道黏膜，与这些部位寄生或感染的各种微生物可能处于共存状态，它们之间的密切接触为微生物之间耐药基因传递提供了可能条件。因此，Uu的耐药基因可能与其它细菌有共同的来源，并可能随着转座子的转座作用在微生物之间水平传递。

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