鞘内七叶皂苷和可乐定混合的协同抗炎症痛作用

　　【摘要】 探讨蛛网膜下腔(鞘内)七叶皂苷及混合可乐定对甲醛炎症痛的治疗作用。【方法】 雄性SD大鼠(250 ～ 300 g)随机分为对照组、七叶皂苷组、可乐定组、混合药物组、拮抗组。蛛网膜下腔置管后注射实验药物，制作甲醛炎症痛模型，观察大鼠行为学改变情况，记录60 min内每5 min的退缩反应时间(s)，采用线性回归的方法计算各药物的半数有效剂量(ED50)及其95%可信区间(CI95)，用等辐射法评价药物的相互作用。【结果】 鞘内单独注射七叶皂苷或可乐定可产生剂量依赖性的抗炎症痛作用;鞘内七叶皂苷和可乐定混合，可以产生明显的协同效应;鞘内育亨宾预处理不能拮抗鞘内七叶皂苷的抗炎症痛作用，而可乐定及七叶皂苷混合可乐定的抗炎症痛作用可被育亨宾拮抗或部分拮抗。【结论】 鞘内单独注射七叶皂苷或可乐定可产生剂量依赖性抗炎症痛作用;鞘内注射七叶皂苷能增强可乐定的抗炎症痛作用。

　　【关键词】 甲醛; 炎症痛; 七叶皂苷; 可乐定; 大鼠

　　Synergistic Effects between Intrathecal Escin and Clonidine on Treatmentf Inflammatory Pain in Rats　LI Qiang， OUYANG Han-dong， HE Wei-xiong， ZENG Wei-an　1. Guangzhou Medical College Cancer Hospital， Guangzhou， 510095; 2. State Key Laboratory of Oncology in SouthernSun Yat-sen University Cancer Center， Guangzhou 510060， China　　Abstract： 【Objective】 To investigate the effects of intrathecal escin and its interaction with clonidine on treatment of inflammatory pain induced by formaldehyde injection. 【Methods】 Male SD rats weighing 250 ～ 300 g were implanted with chronic lumbar intrathecal catheters， and were randomly divided into： group control; group escin; group clonidine; group escin + clonidine and group yohimbine (pretreatment with intrathecal yohimbine before intrathecal administration of escin， clonidine and a mixture of escin and clonidine). The formaldehyde test was used as a model of nociception. Antinociceptive effect was assessed by Biphasic painful behavior (flinch time per 5 min). The dose-response lines were fitted using linear regression analysis， and ED50 values and their 95% confidence intervals (CI95) were calculated. Isobolographic analysis of the escin and clonidine interaction was conducted. 【Result】 Intrathecal escin dose-dependently suppressed the flinch during phase Ⅱ in formaldehyde test. The ED50 of escin alone was 16.71 μg in phase Ⅱ. Intrathecal clonidine produced dose-dependent suppression of the biphasic responses in formaldehyde test. The ED50 of clonidine alone was 4.17 μg in phase Ⅰ and 2.58 μg in phase Ⅱ. Isobolographic analysis showed that the combination of intrathecal escin and clonidine synergistically reduced flinching activity in phase Ⅱ. The experimental ED50 of combination was significantly lower than the theoretical ED50. Intrathecal pretreatment with yohimbine attenuated the effects of clonidine and the combination of escin and clonidine， but antinociception of escin cannot be antagonized by pretreatment of yohimbine. 【Conclusion】 Intathecal escin and clonidine alone produced a dose-dependent treatment effects on inflammatory pain. The enhancing effects were found between intrathecal escin and clonidine.

　　Key words： formaldehyde; inflammatory pain; escin; clonidine; rats

　　炎症痛在临床广泛存在，目前常用非甾体类抗炎镇痛药(NSAID)或阿片类药物进行治疗，但NSAID 类的消化道不良反应及心血管风险限制了它们的应用[1-2]。而阿片类药物的便秘、药物耐受情况在长期用药时发生率极高。因此，临床迫切需要抗炎症痛新药及协同治疗方法。七叶皂苷(Escin)属三萜皂苷类化合物，具有抗炎、抗水肿及增加静脉张力的作用[3]，但是否具有抗炎症痛作用未见报道。本研究通过制作大鼠甲醛炎症痛蛛网膜下腔(鞘内)给药模型，评价了七叶皂苷及混合可乐定的抗炎症痛作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与分组

　　成年SPF级雄性SD大鼠(250 ～ 300 g)，由中山大学实验动物中心提供。大鼠随机分为16组(n = 6)：对照组(生理盐水)、鞘内七叶皂苷组(5、10、20、40 μg)、鞘内可乐定组(1、2、5、10 μg)、鞘内混合药物组为1/2、1/4、1/8、1/16(七叶皂苷ED50 + 可乐定ED50)、鞘内拮抗组(育亨宾20 μg + 可乐定10 μg、育亨宾20 μg + 七叶皂苷20 μg、育亨宾20 μg + 七叶皂苷1/2 ED50 + 可乐定1/2 ED50)。ED50是指能使甲醛炎症痛模型大鼠疼痛反应较对照组减少50%时的药物剂量。

　　实验用药：七叶皂苷(Escin)、可乐定(Clonidine)、育亨宾(Yohimbine)和利多卡因(Lidocaine)均为美国Sigma公司产品。

　　1.2 蛛网膜下腔置管

　　采用Zeng等[4]的方法进行大鼠蛛网膜下腔置管。处死置管后出现运动障碍者，管内注射20 g/L利多卡因(10 μL)，30 s内出现双后肢麻痹则说明导管位置正确。剔除导管位置不正确者，待大鼠恢复4 ～ 5 d后，再进行下一步实验。

　　1.3 蛛网膜下腔用药

　　所有用药均用生理盐水溶解成10 μL溶液，药物注射完后均用10 μL 生理盐水冲洗蛛网膜下腔导管。鞘内用药10 min后制作甲醛炎症痛模型并做行为学测试，完毕后再次判断导管位置是否正确(方法同前)。

　　1.4 运动功能评估

　　按下述方法对大鼠运动功能进行评估：0 = 自由活动无任何限制;1 = 活动受限或后肢运动不协调; 2 = 后肢无力支撑躯体但仍可活动或对疼痛刺激有反应; 3 = 后肢完全瘫痪。

　　1.5 甲醛炎症痛模型制作及行为学测试

　　按Yoon等[5]的方法，用1 mL注射器(25 G针头)将50 μL 20 mL/L甲醛溶液注射到大鼠右后足跖面皮下，剔除局部出血者。甲醛炎症痛表现为典型的双相性，一般认为：0 ～ 5 min为Ⅰ相，5 ～ 10 min 为间歇期，10 ～ 60 min为Ⅱ相。

　　参照文献[6]进行疼痛行为学评分：0分 = 大鼠行为正常，双后肢均承重;1分 = 大鼠被注射肢体轻触玻璃台面，轻微承重或不承重;2分 = 大鼠完全缩回被注射侧肢体;3分 = 舔、咬或抖动被注射侧肢体。以缩腿及舔爪 (即行为学评分 > 2) 作为退缩反应(Flinch)的标准，以0 ～ 10 min 为Ⅰ相，11 ～ 60 min为Ⅱ相，记录60 min内每5 min的退缩反应时间(s)。

　　1.6 数据处理及统计学分析

　　以每5 min的退缩反应时间绘制时间-反应曲线，用线性回归方法计算七叶皂苷和可乐定Ⅰ、Ⅱ相ED50及其95%置信区间(95% Confidence intervals，CI95)。为计算ED50，以实验组与对照组退缩反应时间比 × 100%作为抗伤害作用百分比(maximal possible effect， rMPE)， ED50即 rMPE = 50%时的药物剂量。 根据得到的两药的ED50进行混合组的实验，用线性回归的方法计算两药混合时各自的ED50及CI95。参照文献描述[7]的辐射分析法(Isobolograms)对七叶皂苷和可乐定的相互作用进行评价。将可乐定和七叶皂苷的ED50及其CI95分别标注于x轴和y轴上，连接两药ED50而成的直线就是两药混合作用时的理论相加线。同时，在图中标示出混合组两种药物各自的ED50及其CI95。假设两药混合使用仅有相加作用，按文献[8]的方法计算理论上两药各自的ED50，标注于理论相加线上。数据以均数 ± 标准误(x ± sx)表示，组间对比采用SPSS 13.0进行单因素方差分析，七叶皂苷-可乐定混合用药组理论ED50和实验ED50比较采用t检验。P < 0.05认为有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 七叶皂苷抗炎症痛作用

　　两组大鼠用药后均未发现运动功能异常。注射甲醛溶液后，大鼠立即出现疼痛反应，表现为抬高、舔咬注射足，可观察到完整的双相疼痛反应。鞘内注射七叶皂苷5、10、20、40 μg对甲醛炎症痛Ⅰ相无明显抑制作用;鞘内注射5、10 μg七叶皂苷对Ⅱ相痛有微弱抑制作用，但无统计学意义;而注射20、40 μg时则产生了明显抗炎症痛作用(P<0.01)，其峰值出现在40 min左右，且呈明显的剂量依赖性(图1)，其ED50为16.71 μg(CI95为11.06 ～ 22.36 μg)。

　　2.2 可乐定抗炎症痛效应

　　鞘内可乐定1 μg对甲醛炎症痛Ⅰ、Ⅱ相有微弱抑制作用，但无统计学意义;鞘内可乐定2 μg对Ⅱ相痛有一定抑制作用(P < 0.05);剂量达5 μg 和10 μg时对Ⅰ、Ⅱ相疼痛均有明显抑制作用(P < 0.01)，其峰值在40 min左右，且有明显的剂量依赖性(图2)，其I相ED50为4.17 μg(CI95为0.05 ～ 5.29 μg)，Ⅱ相ED50为2.58 μg(CI95为0.51 ～ 3.64 μg)。

　　2.3 混合给药抗炎症痛作用

　　鞘内混合给药1/16 ED50组(七叶皂苷1 μg +可乐定 0.2 μg)和1/8 ED50组(鞘内七叶皂苷2 μg +可乐定 0.4 μg)组对Ⅰ、Ⅱ相痛均无明显抑制作用;鞘内1/4 ED50组(七叶皂苷4.2 μg +可乐定 0.7 μg)对Ⅱ痛有抑制作用(P < 0.01)，但对Ⅰ相痛无作用;鞘内1/2 ED50组(七叶皂苷8.4 μg + 可乐定 1.3 μg)对Ⅰ、Ⅱ相痛均有明显的抑制作用(P < 0.05和P < 0.01)，其峰值出现在35 min左右(图3)，两种药物合用对Ⅱ相痛抑制作用的实验ED50分别为：七叶皂苷3.17 μg (CI95 2.17 ～ 4.18 μg)、可乐定0.49 μg (CI95 0.34 ～ 0.65 μg);理论(相加作用) ED50为：七叶皂苷8.35 μg (CI95 5.71 ～ 10.00 μg)、可乐定1.29 μg (CI95 0.88 ～ 1.70 μg)。

　　因七叶皂苷单独用药对Ⅰ相痛无明显抑制作用，我们未能对混合用药时Ⅰ相炎症痛的作用进行进一步定量分析。等辐射分析法显示混合用药时，抑制Ⅱ相炎症痛的实际ED50在理论ED50下方，且不与理论ED50的95%置信区间连线相重叠，两者比较有统计学差异(图4)，表明七叶皂苷和可乐定混合用药对甲醛炎症痛(Ⅱ相)有协同抑制作用。

　　2.4 育亨宾鞘内预处理对七叶皂苷或可乐定抗炎症痛作用的影响

　　鞘内预注育亨宾20 μg不能拮抗鞘内七叶皂苷40 μg对Ⅱ相炎症痛的抑制作用，而鞘内注射可乐定10 μg或混合给药(七叶皂苷10 μg + 可乐定2 μg)的抗炎镇痛作用可被鞘内育亨宾预处理部分拮抗(图5、6)。

　　3 讨 论

　　甲醛模型Ⅰ相痛产生机制以外周为主，而Ⅱ相痛则与外周敏化和中枢敏化的关系更为密切。在研究中，我们给大鼠足底注射甲醛后，大鼠立即出现典型双相痛反应，行为学改变和文献报道相符[6]，说明模型能够代表典型炎症痛。

　　实验结果显示，鞘内七叶皂苷40 μg对甲醛Ⅱ相痛有明显抑制作用且不能被育亨宾拮抗。其具体机制尚不清楚，我们推测七叶皂苷可以通过某种途径抑制初级神经元递质(谷氨酸、SP等)或胶质细胞炎性因子(TNF-α等)的释放有关。七叶皂苷具有糖皮质激素样作用，还能直接抑制PGE的生成[9]，抑制背根神经元去极化，干扰中枢敏感化的形成。七叶皂苷还能抑制炎症状态下细胞内ATP的减少，减少磷脂酶A2的增加[10]，间接抑制MAPK p38通路对中枢敏感化的易化作用。七叶皂苷能明显抑制缺血脑组织IL-8及TNF-α的增加，减轻炎症反应，还对大鼠外伤后脑细胞NF-κB的升高有抑制作用[11]。因此，在脊髓水平抑制IL、TNF-α、NF-κB可能是七叶皂苷抗炎性痛的途径之一。七叶皂苷还是选择性5-HT1受体抑制剂[12]，有可能通过脊髓5-HT1受体，抑制中枢敏化的形成。

　　可乐定是选择性α2-肾上腺素受体激动剂，鞘内使用能明显抑制大鼠甲醛炎症痛，该作用可被育亨宾拮抗。其作用机制包括：①作用于突触上α2受体，使神经元P物质释放减少，还可以通过激活磷脂酶C第二信使系统和加速神经细胞膜的Na+/H+交换导致细胞碱化从而产生抗伤害作用;②硬膜外可乐定能抑制IL-6和TNF-α等炎性因子减轻患者术后疼痛[13]。

　　鞘内七叶皂苷混合可乐定对甲醛炎症痛Ⅰ相和Ⅱ相有协同抑制作用，其具体机制尚不清楚。Berenbaum等[14]认为作用于不同位点的药物可以通过共同的作用通道从而产生协同作用，七叶皂苷的抗炎症痛作用可能与其抗炎作用有关，而可乐定镇痛作用也与炎性因子关系密切，两者可能因此具有协同镇痛作用。我们下一步拟通过组织化学或分子生物学技术进行深入研究，以了解鞘内七叶皂苷对脊髓神经元神经递质、受体、离子通道的影响，力图分析其确切作用机理。

　　鞘内七叶皂苷对大鼠甲醛炎症痛Ⅱ相有剂量依赖性的抑制作用，对Ⅰ相无明显作用;鞘内可乐定对大鼠甲醛炎症痛Ⅰ相及Ⅱ相均有剂量依赖性的抑制作用;鞘内七叶皂苷和可乐定混合物对大鼠甲醛炎症痛Ⅰ、Ⅱ相有明显抑制作用，等辐射分析显示两药呈协同作用。

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