二烯丙三硫抑制人前列腺癌细胞生长

作者：郝建伟1, 丘少鹏1, 毛晓鹏1,2。鄢, 陈 羽1, 郭胜杰1, 黄 斌1 作者单位：中山大学附属第一医院 1. 泌尿外科, 2. 东区外科, 广东 广州 510080

　　【摘要】 【目的】 研究二烯丙三硫(DATS)对人前列腺癌PC-3细胞的生长抑制作用及相关机制。 【方法】 MTT法测定DATS对PC-3细胞生长的影响;细胞形态学,流式细胞仪(FCM)等检测细胞凋亡;western blot。比色法分别检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和Bcl-xL/Bcl-xS的表达以及Caspase-3活性变化。 【结果】 DATS明显抑制PC-3细胞的生长,呈浓度和时间依赖性;DATS作用72 h的IC50为14 μmol/L;14 μmol/L DATS作用PC-3细胞不同时间后,细胞凋亡率增高;western blot显示凋亡抑制蛋白Bc1-2。Bcl-xL表达减少,比色法表明Caspase-3活性增高。【结论】 DATS诱导细胞凋亡是其抑制前列腺癌PC-3细胞生长的重要机制,该机制可能与Bc1-2。Bcl-xL和Caspase-3表达及活性变化有关。

　　【关键词】 二烯丙三硫; 凋亡; 前列腺癌

　　中图分类号: R737.25 文献标志码: A 文章编号: 1672-3554(2010)02-0186-04

　　Mechanism of Growth of Human Prostate Cancer Cells Inhibited by DATS

　　HAO Jian-wei1, QIU Shao-peng1, MAO Xiao-peng1,2。鄢, CHEN Yu1, GUO Sheng-jie1, HUANG Bin1

　　1. Department of Urology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China;　2. Department of Surgery, Dongshan Hospital, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China

　　Abstract: 【Objective】 This study was designed to determine growth inhibition of diallyl trisulfide (DATS) in human prostate cancer cells by inducing apoptosis and further to investigate the mechanism underlying such effect. 【Methods】 Growth inhibition by DATS was estimated by the tetrazolium (MTT) assay. Apoptosis induction in DATS-treated cells was assessed by fluorescence microscopy analysis of cells with condensed and segmented nuclei following staining with DAPI and flow cytometric analysis of cells with sub-G1 DNA content following staining with propidium iodide. Protein levels of apoptosis regulating proteins were determined using western blot. The activity of caspase-3 was measured using a colorimetric assay. 【Result】 DATS showed tumor growth inhibition in a time- and dose-dependent manner, IC50 of DATS was 14 μmol/L at 72 h. DATS evoked apoptosis as confirmed by cell morphology and by the analysis of flow cytometry. The expression of Bcl-2 and Bcl-xL, the apoptosis-suppressing proteins, was more down-regulated. The activity of caspase-3 was enhanced by DATS. 【Conclusion】 DATS inhibits growth of prostate cancer cells by inducing apoptosis in association with down-regulation of Bcl-2 and Bcl-xL and activation of caspase-3.

　　Key words: diallyl trisulfide; apoptosis; prostate neoplasm

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci),2010,31(2):186-189;194]

　　近年来研究表明,大蒜素具有抑制肿瘤细胞生长的生物学特性,并可导致细胞凋亡[1-2]。二烯丙三硫(diallyl trisulfide,DATS)是大蒜素中主要的烯丙基有机硫化合物。本文将从细胞凋亡的角度,探讨DATS抑制前列腺癌细胞株PC-3细胞生长的效果和机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　前列腺癌细胞株PC-3由本实验室保存;MTT购于Roche公司;大蒜素(DATS纯度 > 97.98%)购于上海禾丰制药有限公司;CytobusterTM蛋白抽提试剂购于Novagen公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 购于Sigma公司;Caspase-3比色分析试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品;Bcl-2。Bax和Bcl-xL/Bcl-xS 鼠源单抗为Zymed公司产品; ECL 发光试剂盒为PIERCE公司产品。细胞于RPMI-1640培养液(Gibco)含100 mL/L的胎牛血清(Hyclone) 37 ℃。体积分数5%CO2条件下常规培养。

　　1.2 测定DATS的体外杀伤作用

　　PC-3细胞以3.0 × 103/孔接种96孔板,细胞过夜贴壁后换含0。5。10。15。20。25。30。60 μmol/L的DATS培养液。每个浓度6个复孔。MTT法测定加药后24。48。72 h的D (570 nm),计算细胞存活率。细胞存活率(%) = 用药组活细胞D值/对照组活细胞D值 × 100%。以细胞数减少50%的药物浓度确定DATS的IC50。

　　1.3 细胞形态学观察

　　14 μmol/L(72 h的IC50) DATS作用后的细胞在倒置显微镜下观察形态学变化,并拍照。

　　1.4 细胞凋亡检测

　　1.4.1 细胞凋亡率的检测 14 μmol/L DATS作用24。48。72 h, 混合贴壁和悬浮的细胞,PBS冲洗,离心,用700 mL/L乙醇固定,进一步离心后,用80 μg/mL 的RNase A和50 μg/mL的碘化丙啶处理,流式细胞仪(FCM)检测分析DNA内容。未处理细胞作为阴性对照。

　　1.4.2 DAPI染色 14 μmol/L DATS作用后,用40 g/L多聚甲醛固定药物处理的细胞,PBS冲洗,用10 μg/mL DAPI染色细胞,在放大200倍的荧光显微镜检测凋亡细胞,DAPI染色后细胞核浓缩和破裂的细胞为阳性细胞。未处理细胞作为阴性对照。

　　1.5 Western blot检测Bcl-2,Bax和Bcl-x表达

　　14 μmol/L DATS作用24。48。72 h,用预冷的CytobusterTM蛋白抽提试剂裂解细胞并分离上清。用BCA法分析测定蛋白浓度。取等量总蛋白行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印于PVDF膜,50 g/L脱脂奶粉封闭,用Bcl-2,Bax和Bcl-xL/Bcl-xS的鼠源性单抗孵育PVDF膜4 ℃过夜,辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠二抗处理PVDF膜,ECL发光液显影,曝光。Western blot检测内参α-tubulin的蛋白表达。条带密度用Image-ProPlus 6.0 软件定量。重复3次。

　　1.6 比色分析法测定Caspase-3活性

　　14 μmol/L DATS作用PC-3细胞24。48。72 h后,消化离心,预冷的裂解缓冲液冰上裂解细胞20 min,4 ℃ 20 000 × g离心3 min,收集上清与Caspase-3底物DEVD-p-NA以及反应缓冲液。DTT。DMSO的混合液,37 ℃孵育4 h,用96孔板在酶标仪405 nm比色。PBS作为阴性对照组。重复3次。样品D (405 nm)值与对照样品D (405 nm)值的比值为Caspase-3活性的百分率。

　　1.7 统计分析

　　计量资料描述采用均数 ± 标准差表示(x ± s),组间的比较采用多因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 DATS的体外杀伤作用

　　MTT结果显示DATS能明显杀伤PC-3细胞,0 ~ 60 μmol/L DATS作用72 h后细胞存活率分别为0,(72 ± 4)%,(63 ± 5)%,(55.9 ± 0.6)%,(40.8 ± 1.9)%,(33.9 ± 1.1)%,(26 ± 4)%,(16.2 ± 1.2)%;不同浓度的DATS作用不同时间后细胞存活率见图1A。DATS的细胞毒性呈明显的时间和剂量依赖性。DATS作用72 h的IC50为14 μmol/L。

　　2.2 细胞形态学变化

　　DATS作用72 h,见PC-3细胞由贴壁脱落,悬浮于培养液中,折光性差,残存的贴壁细胞体积缩小,胞浆浓缩,形态不规则,状态差,出现细胞碎片。对照组细胞贴壁生长,几乎无脱落,胞浆饱满,生长状态良好(图1B,C)。

　　2.3 细胞凋亡的检测

　　流式细胞分析仪检测14 μmol/L DATS处理PC-3细胞24。48。72 h后,sub-G1期细胞百分率分别为(10 ± 4)%,(21.9 ± 2.9)%,(33 ± 4)%;与对照组相比,sub-G1期细胞显著增多,差异有统计学意义(图2A,B)。

　　14 μmol/L DATS作用72 h后,在DAPI染色分析中,与未处理组胞相比,DATS组能观察到核浓缩和破碎的细胞明显增多(图3A,B)。

　　2.4 凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和Bcl-xL和Bcl-xS的检测

　　14 μmol/L DATS作用24。48。72 h后,Bcl-2蛋白和Bcl-xL蛋白表达降低,与未处理细胞相比,差异有统计学意义。而Bax或bcl-xS蛋白水平无变化(图4A-C)。

　　2.5 Caspase-3活性测定

　　14 μmol/L DATS作用16。24。36。48 h后,Caspase-3活性分别为1.11 ± 0.15,1.49 ± 0.17,2.02 ± 0.24,2.66 ± 0.14;24。36。48 h组与对照组相比,差异有统计学意义(图5)。

　　3 讨 论

　　前列腺癌是男性泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一[3],目前对晚期前列腺癌病人仍没有有效的治疗方法。流行病学研究发现饮食中摄入大蒜,可减低不同恶性肿瘤包括前列腺癌的风险。研究表明大蒜中特有的一些有机含硫化合物是抑制肿瘤细胞生长的主要物质,如二烯丙基一硫化物(DAS),二烯丙基二硫化物(DADS),二烯丙基三硫化物(DATS)及S-丙烯丙基硫基半胱氨酸(SAMC)等,其中DATS是大蒜素中主要的有机硫化合物。目前有研究表明,大蒜素能促进肿瘤细胞发生凋亡并抑制肿瘤的生长[4]。那么DATS能否有效抑制前列腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡,其机制是什么,是值得我们研究的问题。本实验表明DATS能诱导人前列腺癌细胞株PC-3细胞凋亡并抑制其生长,对前列腺癌细胞的杀伤作用与时间和剂量呈依赖性,凋亡率从24 h到72 h呈现出时间效应关系。

　　细胞凋亡是程序性细胞死亡的一个方式,是被细胞内一系列相关的分子所调控,并伴随有典型的形态学改变。细胞变小。凋亡小体的形成。细胞核浓缩和破碎以及细胞sub-G1部分增多是细胞凋亡的典型特征[5-6]。本实验中,DATS处理组细胞均可见典型的凋亡细胞增多,与阴性对照组有统计学差异,表明DATS诱导PC-3细胞凋亡是其抑制前列腺癌细胞生长的重要机制之一。

　　由Bcl-2家族蛋白调控的凋亡及其复杂。在这些蛋白中,Bcl-2和Bcl-xL具有抑制细胞凋亡的作用,而Bax和Bcl-xS能诱导细胞凋亡[7-9],Bcl-2/Bax比例降低导致细胞凋亡的发生[10]。我们研究发现DATS处理细胞后,Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平降低,而Bax和Bcl-xS蛋白表达没有改变,Bcl-2/Bax比例的变化促进PC-3细胞凋亡的发生。

　　Caspase-3为半胱氨酸蛋白酶家族中的一员,以酶原的形式存在,凋亡信号可通过使线粒体释放细胞色素C启动凋亡,最终激活Caspase-3,而Caspase-3的活化是染色质凝集。DNA片断化及细胞出泡等凋亡过程所必须的。Caspase-3的活性只有在细胞凋亡早期才能被检测到,随着凋亡的进展,其活性增强,当时间再延长时,Caspase-3活性下降[7]。本研究中,DATS作用后,Caspase-3活性表达增强,与细胞凋亡率的变化相一致。

　　综上所述,DATS可以下调凋亡抑制蛋白Bcl-2。Bcl-xL蛋白表达和增加Caspase-3表达及其活性,诱导前列腺癌细胞株PC-3细胞凋亡,这可能是其具有抗癌作用的重要机制之一。DATS的抗肿瘤效果也为前列腺癌的治疗提供了新思路。

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