RPHPLC法测定大鼠血浆中姜黄素含量

　作者：顾吉晋, 邓英杰, 王 浩, 张伟明, 王 敏 作者单位：(沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110016)

　　【摘要】 目的 采用RPHPLC法测定大鼠血浆中姜黄素的含量。方法 血浆样品经处理后,按以下色谱条件测定姜黄素的含量:DiamonsilC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温:室温;流动相:乙腈2%醋酸溶液(58∶42);流速:1.0 ml/min;检测波长:426 nm.结果 在本色谱条件下血浆中的杂质峰较少,姜黄素和内标物及其他内源性干扰成分可成功分离。采用乙酸乙酯液液萃取法处理血浆样品,萃取回收率最高。在0.1～0.5 mg/L浓度范围内,线性关系良好,回归方程y=0.0026x-0.0756,r=0.9984;日内、日间精密度RSD符合生物样品的分析要求;加样回收率和萃取回收率均在90%以上。结论 所建立的测定大鼠血浆中姜黄素含量的方法简单可行、准确可靠,适用于姜黄素的血药浓度监测。

　　【关键词】 RPHPLC法; 姜黄素; 血浆; 含量测定

　　Determination of curcumin in rat plasma by RPHPLC

　　GU Jijin,DENG Yingjie,WANG Hao,ZHANG Weiming,WANG Min

　　(College of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China)

　　【Abstract】 Objective To develop a RPHPLC method for the determination of curcumin in rats plasma.Method After the plasma was treated,the samples were separated well on a DiamonsilC18 column(4.6 mm × 250 mm,5 μm) under room temperature;the mobile phase was acetonitrile:2% acetic acid solution(58∶42) at a flow rate of 1.0 ml/min;the detective wavelength was 426 nm.Results Curcumin could be successfully separated from internal standard substance and other endogenous interference components under the chromatographic conditions.Liquidliquid extraction method adopted to treat the plasma samples had the highest recovery rate.Between 0.1 and 0.5 mg/L,the method had a good linear relationship,while the regression equation was y=0.0026x-0.0756,r=0.9984;the withinday and betweendays precision RSD were less than 10%;the average method recovery and the average extraction recovery were more than 90%.Conclusion The RPHPLC method for the determination of curcumin in rat plasma is accurate and reliable,which could be applied to determine the curcumin concentration in the blood.

　　【Key words】 RPHPLC method;curcumin;plasma;determination

　　姜黄素(curcumin)是姜科植物姜黄或郁金的根茎中提取出来的一种酚类物质,具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等广泛的药理活性,且毒性低。近年来,国内外的学者对其进行了深入研究。在治疗癌症方面,国内外进行了大量的临床实验,被公认为是治癌疗效好、毒副作用小和价格低廉的药物，应该说姜黄素非常具有开发的潜能和临床应用价值[1]。本研究旨在建立RPHPLC法测定大鼠血浆中的姜黄素含量,为监测姜黄素口服给药后在大鼠体内的血药浓度变化和动力学特征提供参考,也为其新制剂的设计和临床应用提供理论基础和方法。

　　1 仪器与试药

　　高效液相色谱仪(日本岛津);Y1型涡旋振荡器(北京长安仪器厂);TGL16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂);AdventurerTM AR 1140型电子天平(美国Ohaus corp公司);姜黄素(Sigma,含量95%);甲醇、乙腈(色谱纯);其他试剂为分析纯。Wistar大鼠(沈阳药科大学动物中心)。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件的确定

　　2.1.1 色谱条件 色谱柱:DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈2%冰醋酸(58∶42);流速:1.0 ml/min;柱温:室温;检测波长:426 nm;进样量:20 μl.

　　2.1.2 专属性 在上述色谱条件下,姜黄素峰形良好,3种成分可达到基线分离。空白血浆中的内源性杂质较少,在姜黄素色谱峰相应位置处无干扰。姜黄素甲醇溶液、空白血浆和含药血浆样品的色谱图见图1.

　　2.1.3 内标的选择 在分析时,内标最好选择分析物的同系物,但所测药物本身就含有3种同系物成分,分别为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素,其中姜黄素含量在95%以上，所以只能寻找在可见区有最大吸收波长的其他物质充当内标。大黄素在可见光区447 nm处有最大可见吸收,与姜黄素相近,而且在样品处理时,大黄素的萃取回收率与姜黄素基本一致,适合做内标，所以本研究选择大黄素作为姜黄素体内分析的内标。

　　2.2 血浆样品的制备

　　2.2.1 空白血浆的制备 大鼠眼眶取血,将所得的空白血置于涂有1%肝素的离心管中,10 000 r/min离心10 min,吸取上清液,即血浆,立即贮存于-20 ℃的冰箱,备用。

　　2.2.2 模拟体内含药血浆样品的制备 精密量取浓度为4 μg/ml的姜黄素对照品甲醇溶液和大黄素甲醇溶液各50 μl于EP管中,N2吹干。加入200 μl空白血浆,高速旋涡混匀,备用，最终血浆中姜黄素和大黄素浓度分别为1 μg/ml.

　　2.3 萃取回收率的测定方法

　　取甲、乙两只离心管。精密吸取4 μg/ml的姜黄素和大黄素储备液各50 μl于甲管中,N2吹干,备用。乙管中精密加入200 μl含药血浆样品,再加入萃取剂萃取,高速旋涡混合3 min,5 000 r/min离心10 min,离心后的有机层全量转移至另一离心管(丙)内,N2吹干,得到含药物的残渣[2]。于甲、丙两管中分别加入200 μl流动相溶解残渣,5 000 r/min离心10 min,取上清液进样测定,记录色谱峰面积A.萃取回收率(%)=(A丙 /A甲) ×100%.

　　2.4 血浆样品预处理方法的选择[1]

　　2.4.1 直接沉淀蛋白法 蛋白沉淀剂分别选用甲醇和乙腈。精密吸取200 μl含药血浆样品于EP管中,加入500 μl蛋白沉淀剂,高速旋涡混合3 min,5 000 r/min离心10 min,离心后上清液全量转移至另一离心管中,通N2吹干。加入200 μl流动相溶解残渣,5 000 r/min离心10 min,取上清液进样测定。平行重复操作3次，结果见表1.表1 直接沉淀蛋白法处理血浆样品药物回收率

　　2.4.2 液液萃取法 萃取剂分别选用乙酸乙酯和氯仿。精密吸取200 μl含药血浆样品,加入500 μl萃取剂,高速旋涡混合3 min,5 000 r/min离心10 min,离心后将有机层全量转移至另一离心管中,然后再萃取2次,每次萃取剂用量为200 ml.合并3次萃取剂,通N2吹干萃取剂,加入200 μl流动相溶解残渣,5 000 r/min离心10 min,取上清液进样测定,平行重复操作3次[3]，结果见表2.表2 液液萃取法处理血浆样品药物回收率

　　由“2.4.1”和“2.4.2”两种方法结果比较,液液萃取法的药物回收率明显高于直接沉淀蛋白法,故本研究采用液液萃取法处理血浆样品。

　　2.5 液液萃取法处理血浆样品的影响因素考察

　　2.5.1 萃取剂的选择 以萃取回收率作为评价指标,按“2.3”和“2.4.2”方法筛选了乙酸乙酯、乙醚和氯仿3种萃取剂,每个样品平行重复操作3次，结果见表3.由表中数据可知,乙酸乙酯的萃取回收率最高,达90%以上,故选择乙酸乙酯作为萃取剂。表3 萃取剂的种类对药物萃取回收率的影响

　　2.5.2 萃取次数对药物萃取回收率的影响 按“2.3”和“2.4.2”方法,采用乙酸乙酯对含药血浆分别萃取1次、2次、3次。首次萃取时萃取剂的用量为500 μl,第2、3次萃取时萃取剂的用量为200 μl,平行重复操作3次，结果见表4.由数据可知,随着萃取次数的增加,姜黄素的萃取回收率升高。萃取3次,萃取回收率可达90%以上。表4 萃取次数对药物萃取回收率的影响

　　2.5.3 N2吹干萃取剂时加热对药物萃取回收率的影响 按“2.3” 和“2.4.2”液液萃取法,采用乙酸乙酯对含药血浆萃取3次,N2吹干时一组加热,一组不加热。每组均平行重复操作3次，实验结果见表5.由结果可知,在N2吹干萃取剂乙酸乙酯过程中,加热与否对姜黄素的萃取回收率影响不大。表5 N2吹干萃取剂时加热对药物萃取回收率的影响

　　2.5.4 姜黄素和大黄素储备液的加入方式对药物萃取回收率的影响 于EP管中先加入姜黄素和大黄素储备液各50 μl,N2吹干后加入200 μl空白血浆样品,旋涡振荡混合均匀。另一组先于EP管中加入200 μl血浆,然后依次加入姜黄素和大黄素储备液各50 μl.比较两组萃取回收率的差别。每组均平行重复操作3次，结果见表6.加入方式不同对萃取回收率略有影响，可能原因是加入储备液后,血浆稍呈絮状,药物包于颗粒中,影响了萃取回收率。

　　2.6 线性关系的确定

　　2.6.1 标准曲线的制备 配制浓度为1 μg/ml的姜黄素甲醇储备液及4 μg/ml的大黄素甲醇储备液。精密吸取体积分别为20、30、40、50、60、70、80、90、100 μl的姜黄素储备液于EP管中,然后于每个EP管中各加入50 μl大黄素储备液。N2吹干后,精密吸取空白血浆样品200 μl分别加入各个EP管中,高速旋涡混合3 min.最终姜黄素在血浆中的浓度为100、150、200、250、300、350、400、450、500 ng/ml.以乙酸乙酯为萃取剂,按上述最优方案及“2.3”和“2.4.2”方法处理血浆,在“2.1.1”色谱条件下进样分析。以姜黄素的浓度(x)为横坐标,以待测药物的峰面积As与内标物的峰面积Ai之比As/Ai(y)为纵坐标,进行线性回归,回归方程为:y=0.0026x-0.0756,r= 0.9984;线性范围为0.1 ～0.5 mg /L.表6 姜黄素和大黄素储备液的加入方式对药物萃取回收率的影响

　　2.6.2 精密度试验 将0.10、0.25、0.50 mg/L低、中、高3种姜黄素浓度的血浆样品处理后,每个浓度早、中、晚分别各进样3次,连续测定3 d，计算日内精密度和日间精密度。测得药物浓度的日内精密度RSD(n=3)分别为1.76%、2.90%和3.61%;日间精密度RSD(n=3)分别为2.75%、3.40%和6.41%,符合生物样品分析方法的基本要求。

　　2.6.3 方法回收率试验 将0.10、0.25、0.50 mg/L低、中、高3种姜黄素浓度的样品溶液,按上述最优方案处理后进样测定,每个浓度平行测定5次。由标准曲线计算测定值,将测定值除以理论值即为本方法的回收率[4]，结果见表7.表7 大鼠血浆中姜黄素的方法回收率

　　2.6.4 萃取回收率 将0.10、0.25、0.50 mg/L低、中、高3个浓度的含药血浆样品处理后,进样分析,记录内标和各浓度姜黄素的色谱峰面积,相应浓度的姜黄素和大黄素混合溶液不经萃取也分别进样分析,记录峰面积。以每一浓度的血浆样品的峰面积和不经萃取的药物溶液的峰面积之比计算提取回收率[5]，结果见表8.表8 大鼠血浆中姜黄素的萃取回收率

　　3 讨论

　　将姜黄素对照品甲醇溶液在200～600 nm内扫描发现,姜黄素在紫外和可见光区均有最大吸收。但考虑到在低波长处,生物样品中的内源性成分吸收较多,会对姜黄素的分析产生干扰,故将检测波长定为426 nm.在体外姜黄素的色谱条件下姜黄素、去甲氧基姜黄素及去二甲氧基姜黄素仍可较好地分离。

　　血浆样品测定中样品的预处理是影响试验结果的关键所在。本试验分别采用直接沉淀蛋白法和液液萃取法处理血浆样品,结果液液萃取法的萃取回收率远大于直接沉淀蛋白法,且液液萃取法处理的样品杂质少。在直接沉淀蛋白法中,选用甲醇为沉淀剂,蛋白沉淀后呈细小颗粒沉淀,不易分离;选用乙腈为沉淀剂,蛋白沉淀后呈块状絮状物,易于分离。但在蛋白沉淀过程中,有可能蛋白颗粒将药物包封于其中,使药物的回收率大幅降低。在液液萃取法的基础上,本试验从萃取剂、萃取次数、N2吹干时是否加热及储备液的加入方式四方面进行了考察,筛选了最佳的血浆预处理工艺,为以后药物制剂的体内分析奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1] Yvonne Pak,Renata Patek,Michael Mayersohn.Sensitive and rapid isocratic liquid chromatography method for the quantitation of curcumin in plasma[J].Journal of Chromatography B,2003,796(2):339346.

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　　[4] 林瑞红,黄顺旺,曹明成.HPLC法测定降脂宁胶囊中槲皮素的含量[J].中国药房,2008,19(9):687688.

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