从人天然抗体库中克隆IgM抗角蛋白抗体

　作者：王 刚，刘玉峰，王 琰

　　关键词: ZGM;噬菌体;抗体，细菌;角蛋白

　　中图号:R392.11

　　摘 要:目的 克隆制备人源性抗角蛋白IgM抗体. 方法 以人表皮角蛋白为抗原，从人源性天然抗体库中筛选IgM型抗角蛋白人抗体，并用ELISA对所获抗体进行抗原结合活性和特异性等鉴定. 结果 通过3轮“亲和吸附-洗脱-扩增”筛选，获得2株IgM型抗角蛋白噬菌体抗体.酶切去掉载体上的噬菌体基因Ⅲ，得到了可溶性表达的Fab段.经过鉴定，所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性. 结论 从人源性天然抗体库中成功筛选出2株抗角蛋白IgM抗体，为进一步研究抗角蛋白抗体的特性提供了条件.

　　Cloning of anti┐keratin IgM antibodies from a hu┐man natural antibody library

　　WANG Gang，LIU Yu-Feng，WANG Yan

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical U-niversity，Xi'an710033，China，Department of Central Experiment，Navy General Hospital，Bei-jing100037，China

　　Keywords:ZGM;bacteriophages;antibodies，bacterial;ker-atin

　　Abstract:AIM To clone human anti-keratin IgM antibodies from a natural antibody library.METHODS Panning of the natural antibody library against keratin antigen was conduct-ed to select specific IgM antibodies.The antigen binding ac-tivity and the specificity of the isolated binders were deter-mined with ELISA.RESULTS After3rounds of“adhen-sion-amplification-elution”panning，2clones of IgM which could bind specifically to keratin were obtained.After remov-ing the phagesome gene III fragment，soluble anti-keratin Fab antibodies were expressed.CONCLUSION Two human anti-keratin IgM antibodies are successfully selected from the natural antibody library.The isolated antibodies would be useful in exploring the characteristics and the biological ef-fects of anti-keratin antibody.

　　引言

　　以往的研究曾发现人和一些哺乳动物的体内存在有天然抗角蛋白自身抗体(antikeratin autoantibo-dies，AK auto Ab)，其免疫球蛋白类型有IgG，IgM和IgA三种.该自身抗体参与机体免疫状态平衡的维持和调节，而在一些病理情况下又与疾病的发生、发展及转归密切相关[1，2] .为了更加深入和全面地探讨AK auto Ab在体内存在的意义及其生物学作用，我们继成功克隆和表达了IgG型人源性抗角蛋白抗体之后[3] ，又从人源性天然抗体库中筛选得到了抗角蛋白IgM抗体.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　2×YT培养液:16g?L-1 蛋白胨，10g?L-1 酵母提取物，5g?L-1 氯化钠;TYE琼脂培养基:15g?L-1 琼脂，10g?L-1 蛋白胨，5g?L-1 酵母提取物，8g?L-1 氯化钠;各种内切酶均为Promega产品，AMV逆转录酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自GibcoBRL;E.coli TG1，XL1-Blue和辅助噬菌体VCSM13为实验室常规保存;人表皮角蛋白(5g?L-1 )由本室制备.人源性天然抗体库由海军总医院中心实验科构建，系从未经免疫的健康志愿者分离淋巴细胞，扩增多样性IgG，IgM基因并克隆到噬菌体抗体Fab段表达载体所建成，见文献[4].抗体库库容为1×109 ，有效重组率80%，其中IgM占75%，IgG占25%.取-70℃冻存的抗体库质粒电转化E.coli TG1对抗体库进行扩增，在含有200g?L-1 葡萄糖和100mg?L-1 氨苄青霉素(Amp)的2×YT培养液中扩大培养后以辅助噬菌体VCSM13诱导表达噬菌体抗体.表达上清中加聚乙二醇(PEG)8000到40g?L-1 ，NaCl到30g?L-1 ，冰浴30min后离心，将沉淀溶于10g?L-1 BSA-PBS中存4℃备筛选用.取少许适当稀释，感染半对数期生长的E.coli TG1铺琼脂平板计算扩增后的抗体库滴度.

　　1.2 方法

　　1.2.1 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选

　　抗体库的筛选采用固相化抗原免疫吸附筛选法，见文献[5].将人表皮角蛋白包被抗原管(Immunotube，Nunc)4℃过夜，次日弃包被液，以30g?L-1 BSA-PBS封闭后加抗体库上清0.5mL，10g?L-1 BSA-PBS1.5mL混匀，室温孵育2h;用含500μL?L-1 Tween-20的PBS液和PBS溶液各洗10次(第2、3轮各洗20次);加0.1mol?L-1 三乙胺(TEA，Sigma)1mL旋转10min洗脱.吸出洗脱液立即加入0.5mL1mol?L-1 的Tris-HCl(pH7.4)中和，取其中0.25mL与3倍体积的15g?L-1 BSA溶液混匀，置于一新的未包被抗原的抗原管中37℃静置30min以去除非特异结合的噬菌体抗体.移入离心管中感染半对数期生长的E.coli TG1，取适量感染后菌液稀释后铺TYE-Amp琼脂平板测定洗脱液滴度，其余菌液扩大培养后以VCSM13超感染并振荡培养过夜，次日收上清浓缩即为次级噬菌体抗体库，可用来进行下一轮的筛选.滴定次级抗体库的滴度并计算每一轮筛选噬菌体投入/产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标.

　　1.2.2 阳性克隆的挑选

　　从第三轮筛选生长菌落的琼脂平板上随机挑取10个单集落在含Amp的2×YT中培养，用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达噬菌体抗体.以人表皮角蛋白为抗原进行ELISA反应，3个复孔，显色阳性的克隆再以人表皮角蛋白、人IgG、胃蛋白酶、HBsAg等抗原同时包被ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性，所用二抗为HRP-抗M13.

　　1.2.3 IgM抗体的鉴定

　　噬菌体抗体表达载体(p3MH)和IgM CH1内各含有一个EcoRI位点，而IgG CH1无此位点，因此可用EcoRI酶切的方法鉴定所获特异性抗体的免疫球蛋白类型.噬菌体抗体质粒经酶切、电泳释放出约1.5kb条带者为IgM. 1.2.4 可溶性Fab的表达与活性鉴定 将筛选获得的抗角蛋白噬菌体抗体质粒DNA以NheI酶解切除基因Ⅲ，载体自连后电打孔转化E.coli TG1感受态细胞，铺TYE盘培养过夜，次日挑取单集落在2× YT中培养，加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，Promega)至1mmol?L-1 诱导培养过夜后收细菌上清即含可溶性Fab抗体.ELISA实验包被羊抗人Fab检测上清中人Fab的表达，包被人表皮角蛋白及无关抗原检测与角蛋白的结合活性及其特异性，所用二抗均为HRP-羊抗人Fab.

　　2 结果

　　2.1 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选

　　经过3轮筛选，噬菌体抗体回收率得到约20倍富集.从最后一轮挑取的10个单菌落制备噬菌体抗体，用ELISA方法进行检测(每种抗原设3个复孔)，结果发现有3个克隆的噬菌体抗体能与角蛋白特异性结合(Tab1).其中克隆1和克隆2经EcoRI酶切释放出约1.5kb条带为IgM(Fig1).

　　表1 筛选所获噬菌体抗体与不同抗原结合的ELISA反应(略)

　　Tab1 ELISA results of the isolated phage antibodies(Phabs)with different antigens

　　图1 筛选所获抗体免疫球蛋白类型的酶切鉴定(略)

　　Fig1 Gel analysis of Ig-class of the isolated anti-keratin an-tibodies

　　2.2 可溶性Fab段的表达

　　将2个阳性IgM克隆质粒切除噬菌体基因Ⅲ，IPTG诱导后进行ELISA检测，结果均表达出了人Fab段.经过与不同抗原的ELISA反应(均设3个复孔)，显示所获抗体为角蛋白特异性抗体(Tab2).

　　表2 筛选所获IgM-Fab段与不同抗原结合的ELISA反应(略)

　　Tab2 ELISA results of isolated IgM-Fabs with different antigens

　　国内外一系列的研究证明，包括AK auto Ab在内的多种天然自身抗体广泛存在于人及多种动物体内[6-8] ，在机体清理排除衰老的细胞及其抗原、防御感染和肿瘤的发生、维护自身免疫状态稳定等方面发挥生要作用[9，10] .一组实验数据表明，AK auto Ab可能协助吞噬细胞吞噬、处理衰老的角质形成细胞，并能封闭由该细胞凋亡或崩解释放出的自身蛋白抗原，避免自身免疫反应的发生[1，2] .在一些病理情况下如银屑病、接触性皮炎等，AK auto Ab的存在对于限制病性进展、促进疾病恢复具有积极意义，给患者补充抗解蛋白抗体对这些疾病有可能起到治疗作用[1，11，12] .因此，制备人源性抗角蛋白抗体将能够极大地方便对AK auto Ab的研究，并为进一步探讨其临床应用奠定基础.AK auto Ab有IgM，IgG和IgA3种类型，在生物学特性和作用方面各具特点[2，10] .我们在以往的研究中曾经从正常人血清中提取纯化了IgG型AK auto Ab，又从半合成噬菌体抗体库中成功克隆并表达了人源性抗角蛋白IgG，并初步掌握了其免疫学活性和对角质形成细胞增生的影响[2，3，11，12] .但是迄今为止对IgM抗角蛋白抗体的研究较少，认识比较局限.本实验利用基因工程技术，从我们先前构建的由IgG和IgM组成的人天然抗体库中淘筛得到了IgM型抗角蛋白人抗体.这种抗体的获得为揭示IgM抗角蛋白抗体的作用、全面了解不同类型AK auto Ab的生物学差异、筛选具有临床应用前景的抗角蛋白抗体提供了极大的方便.

　　噬菌体抗体库是当前制备人抗体的一种有效手段，特别是通过构建大容量的天然抗体库或半合成抗体库已经实现了不经免疫而直接制备多种人抗体[13，14] .我们先后构建了半合成噬菌体抗体库和人源性天然抗体库，并从中筛选到多种人抗体，进一步证实了噬菌体抗体库用于人抗体克隆的可行性.本研究经过一次3轮的筛选就顺利地得到3株特异性抗角蛋白抗体，说明该抗体库的性能良好.虽然抗体库是由IgG，IgM混合而成，但由于其中的IgM具有 特异的酶切位点，因此很容易区分所获抗体的免疫球蛋白类型.筛选获得的抗角蛋白抗体在与抗原结合的活性和特异性方面未发现IgG和IgM之间存在明显差异，3个阳性克隆中有2个属于IgM，这可能与抗体库中IgM的比例较高(占60%[4] )有关.

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