抗角蛋白自身抗体亲和力成熟及其免疫学意义

作者：夏汝山，刘玉峰，李承新，李 巍

　　关键词: 兔;自身抗体;角蛋白;抗体亲和力

　　中图号:R446.62;R758.2

　　摘 要:目的 检测同种抗角蛋白自身抗体(rAK auto Ab)反复注射家兔后，其血清AK auto Ab与角蛋白亲和力的动态变化. 方法 采用亲和层析法纯化rAK auto Ab，5mg kg-1 肌肉注射，隔日一次，连续8wk，ELISA法检测不同时间点家兔血清中AK auto Ab与家兔角蛋白的反应强度. 结果 实验组家兔血清A490nm 随时间推移而增加，对照组家兔血清A490nm 则基本保持不变. 结论 长期大量应用rAK auto Ab的家兔血清中，rAK auto Ab与角蛋白的亲和力随时间推移而增加.

　　Affinity maturation of antikeratin autoantibody and its immunological significance

　　XIA Ru-Shan，LIU Yu-Feng，LI Cheng-Xin，LI Wei

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical U-niversity，Xi'an710033，China

　　Keywords:rabbits;autoantibodies;keratin;antibody;affini-ty

　　Abstract:AIM To observe the dynamic changing of the affinity of sera antikeratin autoantibodies to keratin after allo-genic AK auto Ab was injected with large dose for long-term.METHODS Allogenic AK auto Ab was purified by affinity chromagraphy colume and was injected(5mg/kg)intramus-cularly to rabbit once every other day for8weeks.Affinity of sera antikeratrin autoantibodies to keratin was detected by ELISA.RESULTS A gradually，however the A490nm of control group did not change much.CONCLUSION Affinity of antikeratin autoantibodies to keratin might increase gradually when allogenic AK auto Ab is administrated with large dose for long-term.

　　引言

　　家兔抗角蛋白自身抗体(rabbit antikeratin au-toantibodies，rAK auto Ab)是天然自身抗体家族的一员，广泛存在于人及多种动物体内，在机体及皮肤的生理和病理过程中具有重要作用.研究证明短期应用低亲和力人AK auto Ab对家兔银屑病样皮炎和接触性皮炎模型具有明显治疗作用[1] ;还发现低亲和力家兔AK auto Ab抑制细胞因子IL-6和IL-8的产生[2] .为了进一步了解长期反复应用rAK auto Ab后，rAK auto Ab与家兔角蛋白亲和力的动态变化，探索AK auto Ab临床应用的前景，我们检测了rAK auto Ab的亲和力及亲和指数，并对其免疫学意义进行了讨论.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　新西兰白兔(本校实验动物中心，医动字第08-015号);兔角蛋白亲和层析柱[3] 和rAK auto Ab(本室制备);羊抗兔IgG-HRP(华美公司);OPD(北京芳草制药公司).

　　1.2 方法

　　采用亲和层析法从健康家兔混合血清中提取rAK auto Ab[4] ，透析除盐后浓缩调整浓度至5g L-1 ，临床注射用生理盐水;20只家兔随机分为两组，每组10只分别对应于rAK auto Ab组和生理盐水组;肌肉注射药物，rAK auto Ab组剂量为5mg kg-1 ，生理盐水组给予2mL注射.以后隔日一次，剂量同前，连续8wk;肌肉注射药物前从耳静脉采血，以后每隔1wk采血一次，离心后血清-20℃冻存.8wk后处死家兔.硫氰酸盐洗脱法测定相对亲和力(亲和指数):0.05mol L-1 pH9.6Na2 CO3- NaHCO3 缓冲液加入角蛋白，稀释至2.5mg L-1 ，加入酶标板，每孔100μL，4℃过夜;加待测血清每孔50μL，37℃孵育2h，0.5g L-1 Tween-20-PBS液振洗3次;加入NH4 SCN每孔50μL，室温静置15min;加1 1000IgG-HRP100μL，37℃孵育1h;加新鲜配制的OPD每孔100μL，显色5min.加2mol L-1 H2 SO4 终止反应，测A490nm 值.

　　2 结果

　　经统计学处理，实验组家兔和对照组家兔血清rAK auto Ab与角蛋白的A490nm 有显著性差异(P<0.01)，实验组家兔学清rAK auto Ab与角蛋白的A490nm 随着时间的推移而增加;对照组家兔血清rAK auto Ab与角蛋白的亲和力基本保持平稳(Fig1).

　　图1 rAK auto Ab与家兔角蛋白A490nm 的变化(略)

　　Fig1 Change of A490nm of rAK auto Ab to rabbit keratin

　　2.1 亲和指数

　　抗体与抗原结合的A490 在经洗脱后下降至50%时的NH4SCN浓度即为该抗体的亲和指数，以mol L-1 表示.对照组家兔血清的平均亲和指数(mol L-1 )为0.09±0.04;实验组家兔血清在不同时间的平均亲和指数(mol L-1 )分别为0.12±0.08，0.20±0.10，0.18±0.10，0.20±0.10，0.22±0.13，0.21±0.12和0.22±0.12.

　　3 讨论

　　天然自身抗体广泛存在于人及多种动物体内，大量证据表明，在健康人和鼠，NAA由没有经过广泛染色体突变和亲和力成熟的基因编码，表现为广谱的亲和力，其分离常数为10-8 ～10-5 M[5] ;在正常个体显示多反应性，对广泛的抗原，尤其是细胞骨架、核蛋白和DNA显示低亲和力.有研究表明，CD5+ B细胞可以产生高亲和力自身抗体[6] ，CD5- B细胞亦可产生多反应性天然自身抗体[7] ，这两种细胞产生的天然和疾病相关抗体在抗体产生的动力学、CDRs氨基酸序列以及多反应性等方面可能存在不同，但尚不明确[8，9] .

　　高亲和力自身抗体包括有针对外来抗原的抗体 和针对自身抗原的抗体，后者可以是病理性自身抗体也可以是具有重要作用的生理性自身抗体，在SLE患者，有研究发现了高亲和力病理性自身抗体，典型的疾病相关自身抗体通过抗原选择，经历亲和力成熟，随后发生广泛的染色体突变，它的产生可能来自异常的免疫调节[10，11] ;Wang[12] 通过噬菌体库技术，制备成功了亲和力成熟的人源性抗角蛋白抗体克隆，在体外实验中已经初步证明其对角质形成细胞的增生同样具有抑制作用.

　　rAK auto Ab作为天然自身抗体家族的重要一员，具备天然自身抗体的一系列特点，也具有多反应性和低亲和力，亲和力低的rAK auto Ab在正常个体通过独特型和抗独特型网络参与多种生理活动.

　　本实验中用相同浓度的NH4 SCN检测家兔注射rAK auto Ab前后的A490nm 值，发现实验组家兔的A490nm 值逐渐升高，对照组家兔的A490nm 值保持平稳，说明实验组家兔rAK auto Ab与家兔角蛋白的亲和力有成熟的趋势;用不同浓度的NH4SCN检测rAK auto Ab与家兔角蛋白的亲和常数，rAK auto Ab组家兔的亲和常数与对照组相比有递增趋势，说明通过反复免疫rAK auto Ab可以达到亲和力的成熟[13] ，其具体作用机制尚不明确.通过反复免疫家兔获得的高亲和力rAK auto Ab生物学特性如何，高亲和力与低亲和力rAK auto Ab在体内的作用有何不同，尚有待进一步研究，该问题的阐明有助于揭示生理性与病理性自身抗体、高亲和力与低亲和力自身抗体的区别，有助于揭示天然免疫以及主动免疫的关系.

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