人角蛋白K6a cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

作者：张海龙，武彩霞，刘玉峰，高天文，赵小东

　　关键词: 角蛋白;角蛋白;逆转录聚后酶链反应;克隆，分子

　　中图号:R246.7

　　摘 要:目的 克隆并表达人角蛋白K6a cDNA. 方法 从人角质形成细胞中提取RNA，以RT-PCR法扩增人角蛋白K6a(1.7kb)cDNA.测序正确，将该片段克隆入表达载体pRSETB中，用IPTG诱导表达. 结果 获得了角蛋白K6a(1.7kb)cDNA片段，并在大肠杆菌中获得高效表达. 结论 获得了人角蛋白K6a(1.7kb)cDNA片段及其原核表达产物，对研究人角蛋白K6a功能有重要意义.

　　Cloning and expression of the cDNA of human ker┐atin6a in E.coli

　　ZHANG Hai-Long，WU Cai-Xia，LIU Yu-Feng，GAO Tian-Wen，ZHAO Xiao-Dong

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Fourth Military Medical U-niversity，Xi'an710033，China

　　Keywords:keratinocytes;keratin;reverse transcriptase polymerase chain reaction;cloning，moleculer

　　Abstract:AIM To clone and express the1.7kb cDNA fragment of human keratin6a.METHODS The1.7kb cD-NA fragment of human keratin6a was amplified from ker-atinocyte total RNA by RT-PCR，then it was cloned into ex-pression vector pRSETB and induced with IPTG.RESULTS The1.7kb cDNA fragment of human keratin6a was cloned.The sequencing indicated that the sequence was iden-tical to that of reports.Then the1.7kb cDNA was cloned into expression vector pRSETB.The keratin6a fragment was highly expressed in E.coli after induced with IPTG.CONCLUSION The1.7kb cDNA fragment of human ker-atin6a is obtained，and it is highly expressed in E.coli，it might be important for study on the function of keratin6a.

　　引言

　　角蛋白是约30个多肽的多基因家族，构成了上皮细胞的中间丝.各种上皮细胞中角蛋白的种类和数量因细胞种类、发育和分化的程度、细胞生长状况的不同而异.成人皮肤的基底层主要由K5/K14角蛋白对组成，基底层以上部分主要由K1/K10组成.正常情况下K6仅见于正常人手掌、足底和甲床.一般认为K6的表达与表皮过度增殖有关，伤口愈合、银屑病、肿瘤或皮肤外用佛波醇酯、维甲酸处理时毛囊内表皮细胞也能诱发K6表达[1，2] .此外，K6见于先天性厚甲、鱼鳞病、非表皮松解性掌者角化病和多发行脂囊瘤等[3-7] .人类有多种K6同种型基因，如K6a，K6b，K6c和K6d基因等[8] .人类K6同种型之间核苷酸和氨基酸序列有很高的一致性.所以角蛋白K6a的克隆与表达对深入研究K6基因的功能和调控奠定了基础，为进一步认识增殖性为主的疾病、寻找有效治疗方法提供了非常有益的帮助.

　　以往对于角蛋白及抗角蛋白自身抗体的研究是采用混合角蛋白，缺乏对单一成分角蛋白及其抗体生物学作用的准确分析.本实验从人角质形成细胞中提取RNA，以RT-PCR法扩增人角蛋白K6a1.7kb cDNA.将该片段克隆入表达载体pRSETB中，用IPTG诱导在大肠杆菌中获得高效表达.

　　1 材料和方法

　　1.1 质粒、菌株与细胞株

　　质粒pRSETB为含有T7启动子的融合表达载体，插入目的基因后，表达蛋白的N端融合6个His，E.coli JM109，E.coli BL21DE3(plysS)，均为生物化学与分子生物学教研室杨辉博士惠赠，人角质形成细胞为正常人包皮原代培养细胞.

　　1.2 工具酶与试剂

　　限制性内切酶、T4DNA连接酶及总RNA提取试剂盒购自GIBCO公司，反转录-PCR试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Promega公司及Clontech公司，山羊抗K6a多克隆抗体购自晶美公司，辣根酶标记鼠抗羊二抗购自北京中山公司.

　　1.3 PCR引物

　　根据人角蛋白K6a成熟肽cDNA序列[9] 设计合成，P1为5'引物序列:GCG AAT TCA TGG CCA GCA CAT CCA CCACC-3';P2为3'引物序列:CCC AAG CTT TTA GTG CTT ATA GCT CTT CCT GCT-3'.两条引物分别含EcoRⅠ，HindⅢ酶切位点，5'端含有起始密码子ATG，，3'端含有终止密码TAA，由中科院上海生物工程研究中心合成.

　　1.4 总RNA提取

　　将原代培养人表皮细胞培养，隔天换液，至贴壁生长细胞数达到105 ，按GIBCO公司总RNA分离试剂盒提取总RNA，溶于30μL水中，紫外定量.

　　1.5 RT┐PCR 提取目的基因片段

　　以提取的总RNA1.0μg为模板，加入P1，P2各50pmol，RT-PCR试剂盒进行反应48℃45min，94℃2min;94℃2min，55℃1min，68℃2min，共40个循环，68℃7min，4℃保存.取10μL RT-PCR产物在10g L-1 琼脂糖凝胶中电泳，观察PCR结果.

　　1.6 目的基因的克隆

　　纯化后的RT-PCR扩增产物及载体pUC19分别经EcoRⅠ，HindⅢ双酶切后，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化JM109，从转化的平板上挑取含所需插入片段的克隆，试剂盒提取质粒，PE公司3700型自动测序仪测序.

　　1.7 重组表达质粒的构建

　　pUC19-K6a重组质粒以EcoRⅠ/HindⅢ双切酶，回收K6a cDNA片段，表达载体pRSETB先用HindⅢ酶切、回收，再用EcoRⅠ酶切、回收.双酶切的线形载体pRSETB和酶切K6a基因片段连接转化E.coli JM109，挑取克隆，酶切鉴定.

　　1.8 K6a成熟肽的诱导表达及Western印记鉴定

　　重组表达质粒pRSETB转化E.coli B12DE3(plysS)，挑取单个菌落，37℃培养过夜，次日晨，按2%转接于2mL LB培养液中，37℃培养至A600nm =0.4时左右，加入IPTG至终浓度0.5mmol L-1 ，37℃培养1～6h诱导表达，收集表达菌，进行120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.SDS-PAGE结束后，采用Bio-Rad转移电泳设备，将蛋白从凝胶转移至NC膜上，经一抗(山羊抗人K6a多抗)、辣根酶标记的鼠抗山羊二抗各温育2h，加显色液室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应.

　　2 结果

　　2.1 RT┐PCR扩增K6a基因

　　以人角质形成细胞提取的总RNA为模板，经RT-PCR扩增出大小为1.7kb的人K6a基因片段，与预计的片段大小相符.

　　2.2 PCR产物的克隆和序列分析

　　PCR产物经纯化、酶切后，定向克隆入pUC19，转化JM109，挑取6个克隆，经酶切鉴定均含有片段，挑取其中一个克隆做序列测定，结果与文献报道[9] 完全一致(Fig1).

　　图1 PCR产物电泳图(略)

　　Fig1 Amplification of k6a cDNA by PCR 1，2:PCR product;3:DNA marker.

　　图2 pRSETB-K6a酶切鉴定图(略)

　　Fig2 Identification of pRESETB-K6a by restriction endonu-clease

　　2.3 K6a重组表达质粒的构建

　　测序正确的K6a基因克隆入表达载体pRSETB中，转化E.coli JM109E3，挑单菌落培养，提取质粒，EcoRⅠ，BamHI双酶切，均可切出1.7kb左右的片段(Fig2)，表达载体pRSETB-K6a构建成功.

　　2.4 K6a表达及Western┐blot检测

　　鉴定正确的表达质粒pRSETB-K6a转化E.coli BL21DE3(PlysS)，获得的表达菌株，经IPTG诱导，120g L-1 SDS-PAGE分析表明，在Mr56×103 处有一条明显的深染的蛋白带，与预计His6-K6a融合蛋白分子量大小基本相符.扫描结果表明His6-K6a表达量占菌体总蛋白的12%.以化学法裂解细菌，离心后取上清和沉淀分别电泳分析，发现表达的His6-K6a基本在沉淀中，说明重组表达His6-K6a是以包涵体形式存在于细菌内(Fig3).

　　我们利用Ni2+Slurry纯化树脂对表达产物进行纯化.His6-K6a的表达产物Western-blot分析结果显示，在NC膜上相应位置处，有一强的杂交信号，而未诱导菌无此阳性信号(Fig4).

　　图3 120g L-1 SDS-PAGE分析(略)

　　Fig3 SDS-PAGE analysis of K6a recombinant

　　3 讨论

　　角蛋白是所有哺乳动物细胞骨架的中间丝之一，角蛋白二级结构是所有中间丝蛋白共有的保守结构，它们由中央为α螺旋的杆状结构域和侧端非螺旋的N末端和C末端结构域构成.螺旋间由三个非螺旋连接肽(linker peptide)L1，L12，L2分割成1A，1B，2A，2B螺旋片段.杆状结构域侧端非螺旋序列在组成和大小方面显示较大的种属差异.非螺旋结构域中定义为E亚区(带电荷区)、V亚区(残基数可变区)、H亚区(高度同源区)的亚结构也具有保守性[10] .所以结构保守的角蛋白亚单位对角蛋白中间丝网络起决定作用，角蛋白中间丝网络又决定着细胞的功能.因此角蛋白K6可以作为研究角蛋白结构与功能关系的理想的模型.

　　角蛋白中间丝在维持上皮细胞结构、功能完整性方面起着重要作用.角蛋白可以和桥粒、半桥粒、基 底膜共同组成一个结构网络，抵抗外来的机械力.还可能与细胞核和胞质中的细胞器构成空间上的联系，在胞核和细胞表面之间传递信息[11-13] .人类角蛋白K6在多种上皮组织中表达，但在以增殖率加强或异常分化为特征的复层上皮有很强的诱导性表达.这些研究表明，K6的表达与细胞的增殖与分化密切相关，但其因果关系尚需进一步探讨研究.角蛋白K6a克隆与表达为深入研究上皮细胞中角蛋白的功能及其与疾病的关系奠定了基础.

　　图4 His6-K6a的Western-blot分析结果(略)

　　Fig4 Western-blot analysis of expressed His6-K6a 1:Protein marker;2:K6a protein

　　在正常人体内广泛存在针对不同分子量角蛋白的天然抗角蛋白自身抗体.近年的研究发现抗角蛋白自身抗体具有多种生物学作用，如抑制角质形成细胞的增殖、抑制角质形成细胞产生IL-6，IL-8，调节细胞凋亡等[14-16] .但是在这些研究中所用的角蛋白是混合人体角蛋白，抗角蛋白自身抗体多采用亲和层析法提取的血清混合抗角蛋白自身抗体，不能对单一成分角蛋白及其自身抗体进行分析研究.角蛋白K6a基因的克隆与表达有望使抗角蛋白自身抗体的研究进一步深化，研究单一成分角蛋白及其抗体的生物学作用及其相互关系.

　　许多研究表明，角蛋白基因突变可以引起许多皮肤疾病.例如在转基因小鼠的研究中发现，小鼠缺乏功能性K10和K14基因会出现表皮损伤[17，18] ;K4缺陷小鼠易导致内皮细胞脆化[19] .通过对角蛋白K6a基因的研究将有助于我们加深对K6a表达异常相关疾病的认识.从K6a基因中分离出与增殖相关的序列也将为基因治疗以表皮增殖为主要变化的疾病如肿瘤、银屑病等提供广阔的前景.

　　参考文献:

　　[1]Rothnagel JA，Seki T，Ogo M，Longley MA，Wojcik SM，Bundman DS，Ckenbach JRB，Roop DR.The mouse keratin6isoforms are differentially expressed in the hair follicle，foot-pad，tongue and activated epidermis [J].Differentiation.1999;65:119-130.

　　[2]Takahashi K，Yan B，Yamanishi K，Imamura S，Coulombe PA.The two functional keratin6genes of mouse are differentially regulated and evolved independently from their human or-thologs [J].Genomics，1998;53:170-183.

　　[3]Bowden PE，Haley JL，Kansky A，Rothnagel JA，Jones DO，Turner RJ.Mutation of a typeⅡkeratin gene(K6a)in pachy-onychia congenita [J].Nayural Sci，1995;10:363-365.

　　[4]McLean WHI，Rugg EL，Lunny DP，Morley SM，Lane EB，Swensson O，Dopping-Hepenstal PJ，Griffiths WA，Eady RA，Higgins C，Navsaria HA，Leigh IM，Strachan T，Kunkeler L，Munro CS Keratin16and keratin17mutations cause pachyony-chia congenita [J].Natl Genet，1995;9:273-278.

　　[5] Shamsher MK，Navsaria HA，Stevens HP，Ratnavel RC，Purkis PE，Kelsell DP，Mclean WHI，Cook LJ，Griffiths WA，Gschmeissner S，Spurr N，Leigh IM.Novel mutations in ker-atin16gene underly focal non-epidermolytic palmoplantar kera-toderma(NEPPK)in two families [J].Hum Mol GENET，1995;4:1875-1881.

　　[6]Smith FJ，Corden LD，Rugg EL，Ratnavel R，Leigh IM，Moss C，Tidman MJ，Hohl D，Huber M，KunkelerL，Munro CS，Lane EB，McLean WH.Missense mutations in keratin17cause either pachyonychia congenita type2or a phenotype resembling steaocystoma multiplex [J].J Invest Dermatol，1997;108:220-223.

　　[7]Smith FD，Jonkman MF，Vangoor H，Coleman CM，Covello SP，Uitto J，Mclean WHI.A mutations in human keratin K6b produces a phenocopy of the K17disorder pachyonychia con-genita type2[J].Hum Mol Genet，1998;7:1143-1148.

　　[8]Kenzo Takahashi，Rudolph D，Paladini，Pierre A.Coulombe Cloning and charaterization of multiple human genes and cD-NAs encoding highly related typeⅡkeratin6isoform [J].J Biol Chem，1995;270(31):18581-18592.

　　[9]Takahashi K，Paladini RD，Coulombe PA.Cloning and charac-terization of multiple human genes and cDNAs encoding highly related typeⅡkeratin6isoforms [J].J Biol Chem，1995;270(31):18581-18592.

　　[10]Steinert PM，Roop DR.Moleculer and cellular biology of inter-mediate filaments [J].Annu Rev Biochem，1988;57:593-625.

　　[11]AlbersK，Fuchs.Expression of mutant keratin cDNAs in ep-ithelial cells reveals possible mechanisms for initiation and as-sembly of intermediate filaments [J].J Cell Biol，1989;108(4):1477-1493.

　　[12]Steinert PM，Mack JW，Korge BP，Gan SQ，Haynes SR，Steven AC.Glycine loops in proteins:Their occurrence in cer-tain intermediate filament chains，loricrins and single-stranded RNA binding proteins [J].Int J Biol Macromol，1991;13(3):130-139.

　　[13]Eriksson JE，Opal P，Goldman RD.Intermediate filament dy-namics [J].Curr Opin Cell Biol，1992;4(1):99-104.

　　[14]Li CX，Liu YF，Liu YF，Zhang YG.Effects of purified Ak auto Ab on the proliferation of the cultared keratinocytes [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1995;16(6):461-462.

　　[15]Li CX，Wan YH，Liu YF，etc.Influence of natural anti-keratin autoantibodies on cell cycle of human keratinocytes cultured in vitro [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(5):385-390.

　　[16]Xia RS，Liu YF，Li CX，Dang YP，Wan YF，Lu T.In fluence of homologuous antikeratin auto antibodies on serum IL-6and IL-8of rabbit model of contact dermatitis [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(15):1355-1357.

　　[17]Porter RM，S Leitgeb DW，Melton O，Swensson RA，Eady，Magin TM.Gene targeting at the mouse cytokeratin10locus:Severe skin fragility and changes of cytokeratin expression in the epidermis [J].J Cell Biol，1996132:925-936.

　　[18]Lloyd C，Yu QC，Cheng J，Turksen K，Degenstein L，Hutton E，Fuchs E.The basal keratin network of stratified squamous epithelia:Difining K15function in the absence of K14[J].J Cell Biol，1995;129:1329-1344.

　　[19]Ness SL，Edelmann W，Jenkins TD，Liedtke W，Rustgi AK，Kucherlapati R.Mouse keratin4is necessary for internal ep-ithelial integrity [J].J Biol Chem，1998;273:23904-2391.