c┐myc基因蛋白在外阴白斑和外阴鳞癌中的表达及临床意义

作者：樊 昕 ，余春艳，赵一岭

　　关键词: 原癌基因蛋白质c-myc类;外阴白斑;外阴肿瘤;免疫组织化学

　　摘 要:目的 研究c-myc基因蛋白在外阴白斑和外阴鳞癌中的表达. 方法 采用SABC免疫组化法，对71例外阴白斑和21例外阴鳞癌标本进行c-myc基因蛋白检测. 结果 c-myc基因蛋白在正常组织中主要分布在细胞核，外阴白斑各型和鳞癌组织中主要分布在细胞浆.外阴白斑各型与鳞癌组相比较，经χ2 检验，正常组(χ2 =11.072，P<0.05)、增生组(χ2 =5.692，P<0.05)、硬化萎缩组(χ2 =16.488，P<0.05)、混合组(χ2 =6.497，P<0.05)和不典型增生组(χ2 =1.072，P>0.05).21例鳞癌标本，Ⅰ级，Ⅱ级，Ⅲ级中c-myc蛋白的阳性率分别为100.0%(9/9)，85.7%(6/7)，60.0%(3/5). 结论 c-myc基因蛋白的表达和分布与外阴白斑分型有关，外阴鳞癌和不典型增生组织中表达阳性率明显高于外阴白斑各型，c-myc基因蛋白的过度表达可能与外阴鳞癌的发生有一定的关系.

　　Clinical significance and expression of c┐myc gene protein in genitalia leukoplakia and squamous cell carcinoma of vulva

　　FAN Xin，YU Chun-Yan，ZHAO Yi-Ling

　　Department of Dermatology，Tangdu Hospital，Xi`an710038，Department of Pathology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical U-niversity，Xi'an710033，China

　　Keywords:proto-oncogene proteins c-myc;leukoplakia vul-vae;vulvar neoplasms;immunohistochemistry

　　Abstract:AIM To study the expression of c-myc gene pro-tein in genitalia leukoplakia and squamous cell carcinoma of vulva.METHODS The genitalia leukoplakia in71cases and squamous cell carcinoma in21cases were detected with c-myc gene protein by SABC immunohistochemical technique.RESULTS c-myc gene protein was mainly distributed in the cell nucleus in normal tissue and in the cell cytoplasm in hy-perplasia type，atypical hyperplasia and squamous cell carci-noma.χ2 test showed significant difference between the squa-mous cell carcinoma and the other types of benign pathologi-cal changes except the type of atypical hyperplasia(χ2 =1.072，P>0.05):Normal group(χ2 =11.027，P<0.05);hyperplasia type group(χ2 =5.692，P<0.05);sclerotic at-rophic type group(χ2 =16.488，P<0.05);mixed type group(χ2 =6.497，P<0.05).The positive rates of c-myc gene pro-tein in the different stages of squamous cell carcinoma group(21cases)were100.0%(9/9)in stage I，85.7%(6/7)in stageⅡ，and60.0%(3/5)in stageⅢrepectively.CONCLUSION Expression and distribution of c-myc gene protein might be correlated with the types of genitalia leuko-plakia.c-myc gene protein has a higher expression rate in squamous cell carcinoma of vulva and atypical hyperplasia than that in various types of genitalia leukoplakia.These data suggest that overexpression of c-myc gene protein may be re-lated to the oncogenesis of squamous cell carcinoma of vulva.

　　引言

　　c-myc基因是myc癌基因家族中最重要的一员，它与细胞周期、增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生发展等密切相关，目前已经成为肿瘤分子机制研究领域中的热点.近年来，许多学者对该基因在宫颈癌、肝细胞癌、胃癌、何杰金氏淋巴瘤等肿瘤中的表达及作用进行研究，但对该基因在外阴白斑和外阴鳞癌中表达的研究甚少.我们采用c-myc单克隆抗体(mAb)，对外阴白斑及外阴鳞癌进行了免疫组化检测，并探讨了该基因蛋白表达与外阴白斑及外阴鳞癌的关系.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　西安市3家医院1982/2000年病理诊断确诊的外阴白斑71例，根据1976年国际外阴疾病年会(ISSVD)制定的标准[1] 命名，其中外阴白斑增生型23例，硬化萎缩型21例，混合型17例，不典型增生型10例.外阴鳞癌21例，根据WHO标准进行病理诊断与分级，其中Ⅰ级9例，Ⅱ级7例，Ⅲ级5例.另设正常对照组20例，标本取自门诊手术室良性病变手术切缘胸腹部正常皮肤.

　　1.2 方法

　　标本经100mL?L-1 中性甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，连续切片5μm厚，玻片用APES胶处理.免疫组化试剂c-myc mAb(9E10)，HIGH-SABC试剂盒(SA1080)，DAB(ED1022)均购自武汉博士德生物工程有限公司.操作步骤:常规脱蜡至水;蒸馏水新鲜配制3mL?L-1 H2 O2 ，室温10min以灭活内源性酶;微波抗原修复20min;滴加抗原修复液I，室温20min后;滴加正常山羊血清封闭液，室温20min;滴加一抗单克隆抗体c-myc工作液，置湿盒中4℃过夜;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20min;滴加试剂HIGH-SABC，37℃20min;DAB室温显色，镜下控制反应时间，及时终止;苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片.镜下观察:免疫组化阳性信号为棕黄色颗粒，阴性为无颗粒或可疑者.每次试验均设对照实验:阳性对照:用已知c-myc阳性的切片重复染色;空白对照:用PBS代替第一抗体;替代对照:用正常鼠血清代替的抗体.统计方法为χ2 连续校正检验.

　　2 结果

　　2.1 c┐myc基因蛋白细胞定位和分布特点

　　c-myc基因蛋白在正常组织中呈表皮弥漫性或散在分布，以细胞核阳性为主，细胞质阳性散在分布(Fig1);外阴白斑增生型呈表皮全层分布，以细胞质阳性为主，细胞核阳性散在分布，为粗细不一的棕黄色颗粒而且染色较深(Fig2，3);外阴白斑硬化萎缩型和混合型主要分布在基底层，棘层也有散在分布，以细胞质阳性为主(Fig4);不典型增生组织和鳞癌组织中主要分布在间变和癌变的细胞质内，呈局灶性或弥漫性分布(Fig5，6).

　　2.2 c┐myc基因蛋白表达

　　正常组织、外阴白斑及外阴鳞癌中均有c-myc蛋白阳性表达，而阳性率各不相同(Tab1).各组与鳞癌组相比较，正常组(χ2 =11.027)、增生组(χ2 =5.692)、硬化萎缩组(χ2 =16.488)和混合组(χ2 =6.497)均有显著差别(P<0.05)，不典型增生组(χ2 =1.072)无显著差别(P>0.05);各组与硬化萎缩组相比，正常组(χ2 =0.847)和混合组(χ2 =3.412)无显著差别(P>0.05)，增生组(χ2 =5.361)和不典型增生组(χ2 =7.682)有显著差别(P<0.05).不同组织分级的外阴鳞癌中c-myc 基因蛋白的表达阳性率也不相同(Tab2).

　　表1 外阴白斑和外阴鳞癌中c-myc基因蛋白的表达(略)

　　Tab1 c-myc gene protein expression in genitalia leukoplakia and squamous cell carcinoma of vulva

　　表2 不同组织分级的外阴鳞癌中c-myc基因蛋白的表达(略)

　　Tab2 c-myc gene protein expression in squamous cell carci-noma of vulva of different histology grades

　　3 讨论

　　c-myc原癌基因定位于人类染色体8q24，是细胞正常增殖、生长的必需基因，同时具有诱导细胞程序性死亡的作用[2] .已证实c-myc的表达与细胞增生率及促有丝分裂信号转导密切相关[3] .c-myc转录产物参与细胞内其它基因尤其是那些与细胞增殖有关的基因转录调控，起介导生长因子的作用[4] .单独c-myc作用并不引发恶性肿瘤，但其作用是向恶性转化的重要阶段.c-myc过度表达可改变细胞内的基因调控，使细胞易于转化为恶性表型[5-7] .本试验从蛋白水平上发现c-myc在外阴鳞癌中(85.7%)表达阳性率比其它各组均高，说明c-myc基因蛋白可能与疾病的良恶性及恶性程度有关，提示c-myc基因蛋白过度表达可能与外阴鳞癌发生有一定的关系.此外本实验发现正常组织中c-myc基因蛋白阳性表达率较高(35.0%)，且与外阴白斑各型无明显差别，提示研究该基因时不应忽视正常生理功能的机制研究.除此以外我们还发现增生组c-Myc基因蛋白表达阳性率(52.2%)明显高于硬化萎缩组(19.0%)(P<0.05)，再次说明c-myc具有调节细胞增殖分化的作用.近几年研究发现:c-Myc是丝氨酸和苏氨酸磷酸化类的DNA结合蛋白，参与细胞分化调节，促进细胞内由G1 期进入S期[8-11] .细胞在正常生理条件下，PR(retinoblastoma protein)与E2F细胞因子结合，减少游离E2F的数量，游离E2F能激活c-Myc蛋白的功能，c-Myc蛋白的活性增加，结果导致大量G0 期细胞提前进入细胞周期，组织学表现为细胞过度增生，不典型增生甚至癌变[12，13] .

　　图1 c-myc基因蛋白在正常组织中的表达(略)

　　Fig1 c-myc gene protein expression in normal tissue ×40

　　图2 c-myc基因蛋白在外阴白斑增生型中的表达(略)

　　Fig2 c-myc gene protein expression in hyperplasia type of genitalia leukoplakia ×10

　　图3 c-myc基因蛋白在外阴白斑增生型中的表达(略)

　　Fig3 c-myc gene protein expression in hyperplasia type of genitalia leukoplakia ×40

　　图4 c-myc基因蛋白在外阴白斑混合型中的表达(略)

　　Fig4 c-myc gene protein expression in mixed type of genitalia leukoplakia ×40

　　图5 c-myc基因蛋白在外阴鳞癌中的表达(略)

　　Fig5 c-myc gene protein expression in squamous cell carcinoma of vulva ×10

　　图6 c-myc基因蛋白在外阴鳞癌中的表达(略)

　　Fig6 c-myc gene protein expression in squamous cell carcinoma of vulva ×40

　　c-Myc蛋白定位研究仍有争议，本试验正常组织呈细胞核分布，外阴白斑各型和鳞癌组织呈细胞质分布，证实了Lpke等[14] 的观点，即细胞良恶性决定c-Myc蛋白分布:恶性肿瘤细胞呈胞质分布，正常上皮呈细胞核分布.外阴白斑病变具有表皮与真皮增殖不同程度变性的改变，外阴白斑增生型以表皮增殖为主，而不典型增生则是在增殖的基础上出现异型性改变，病变以真皮乳头与上皮基底层较明显，外阴白斑增生型和不典型增生型都与外阴鳞癌的发生有密切的关系.本结果虽然显示外阴鳞癌c-Myc蛋白阳性表达率明显高于外阴白斑增生型，但与不典型增生型无显著性差异并且增生型与不典型增生型之间也无显著差异.这提示增生作为机体防御外界刺激的一种代偿反应，只有当这种代偿出现上皮基底细胞分化失调时才出现不典型增生或原位癌的组织学表现，外阴白斑增生型在向不典型增生甚至外阴鳞癌的转化过程中，c-myc基因表达不是唯一因素.c-myc在肿瘤形成中的激活方式主要是通过基因扩增或过度表达在鳞癌发生发展过程中起作用，可作为一种判定恶性肿瘤程度的一种标志，其蛋白的表达与病变部位有关[15] .肿瘤组织以糖酵解为主要供给能量的来源，尤其是恶性肿瘤中，即使是在有氧条件下，仍以糖酵解形式供给能量，在外阴白斑增生型和外阴鳞癌糖酵解都处于高水平[16] ，c-myc又是参与糖酵解调控中的重要基因，提示在基因水平可以显示该病变与正常细胞间的区别.c-myc具有调控正常细胞增殖的作用，同时也调控着细胞凋亡，在许多肿瘤形成过程中其表达失控.最近研究显示外阴白斑增生型及不典型增生病变与bcl-2基因有相关性，该基因表达抑制凋亡，使得细胞长时间生存，产生基因不稳定性，更易使得其他致癌因素包括c-myc基因产生联合作用[17] .

　　从我们检测结果看，外阴鳞癌与不典型增生在c-myc基因表达水平无明显差异，不但提示癌前病变和肿瘤一样都处于活跃的增殖状态，而且预示外阴鳞癌可以在癌前病变的早期通过c-myc基因的检测辅助病理检查进一步明确诊断，此外可以从该基因蛋白分布特点和阳性表达上鉴定病理上尚未有实质性改变的的患者，及时发现并指导正确诊治.本文初步探讨了c-myc基因表达与外阴白斑和外阴鳞癌的关系，而外阴鳞癌发生及发展是一个复杂的过程，c-myc基因在外阴鳞癌以及其他恶性肿瘤中的作用还有待更深入的研究.

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