外阴白斑组织中人乳头瘤病毒的快速检测与基因分型

作者：沈 柱，余春艳，崔大祥

　　关键词: 乳头状瘤病毒，人;反向点探针杂交;外阴白斑;基因型

　　摘 要:目的 为探讨人乳头瘤病毒(HPV)与外阴白斑发生的关系，应用通用引物聚合酶链式反应和反向点探针杂交方法对58例外阴白斑进行HPV6，11，16，18，31，33等型别进行快速检测及基因分型. 方法 将上述6个病毒型别的特异性寡核苷酸探针依次固定在尼龙膜上，再与经通用引物PCR扩增的DNA靶序列杂交，即可在同一张膜上分辨出6型HPV DNA的任一型或几型. 结果 在我们检测的58例外阴白斑患者中，总阳性检出率为37.9%(22/58).其中，HPV6型7例(31.8%)、HPV11型5例(22.7%)、HPV6/11型(混合型)2例(9.1%)、HPV16型10例(45.5%)、HPV18型1例(4.5%)、HPV31型0例、HPV33型1例(4.5%).经统计学分析，外阴白斑的发生与患者感染HPV有显著相关性(P<0.01). 结论 良性型HPV(HPV6，11，6/11)与恶性型HPV(HPV16，18，33)可能均与外阴白斑的发生有关.

　　Rapid detection and genotyping of human papillo┐mavirus in patients with vulvar leukoplakia

　　SHEN Zhu，YU Chun-Yan，CUI Da-Xiang

　　Department of Dermatology，Tangdu Hospital，Xi'an710038，China，Institute of Genetic Diagno-sis of Chinese PLA，Fourth Military Medical Uni-versity，Xi'an710033，China

　　Keywords:papillomavirus，human;reverse hybridization blot probe assay;leukoplakia vulvae;genotype

　　Abstract:AIM To establish the correlation between the in-fection of human papillomavirus and occurrence of vulvar leukoplakia.METHODS A reverse hybridization blot probe assay was used.Six sequence-specific oligonucleotides of HPV DNA(types6，11，16，18，31and33)were used as specific probes and were fixed separately on a strip of nylon mem-brane，which could be used to hybridize with the PCR-ampli-fied target DNA-sequence，so that we could detect and identi-fy any one of the6types of HPV on the same strip.Paraffin sections of58patients with vulvar leukoplakia were tested for the presence of HPV by this assay and a general-primer based PCR.RESULTS 22out of58(37.9%)specimens tested were positive for HPV DNA by PCR，of which7were posi-tive for HPV6(31.8%)，5for HPV11(22.7%)，2for HPV6/11(mixed type)(9.1%)，10for HPV16(45.5%)，1for HPV18(4.5%)，0for HPV31，1for HPV33(4.5%).Statistical analysis revealed that there was marked correlation between the pathogeny of vulvar leukoplakia and HPVs(P<0.01).CONCLUSION Infection of human papillomavirus may play a role in the occurrence of vulvar leukoplakia.We have identified both the benign and the malignant type HPVs in the vulvar leukoplakias.

　　引言

　　外阴白斑多见于中年以上妇女，好发于阴蒂、小阴唇和大阴唇内侧，损害为大小、数目、形态不一的肥厚性斑片或斑块，自觉症状常为瘙痒.关于外阴白斑是否为一种癌前病变，目前尚存在不同观点[1] .其病因到目前为止，也尚不完全清楚，近年来国内外有报道其发生可能与人乳头瘤病毒感染有关[2，3] .人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)广泛感染人类皮肤、生殖道、呼吸道等上皮组织，已被证实与多种良、恶性肿瘤(如尖锐湿疣、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、肺癌等[4] )的发生有关.其中HPV-6，11型与90%以上尖锐湿疣的发生有关，宫颈癌的发生以HPV-16，18等高危型的比重为高[5] .因此快速、准确地检测HPV及区分型别，对于生殖区癌前病变及肿瘤的早期发现、预防及愈后监测是十分重要的.

　　近年来，由于核酸杂交技术的应用，分离出来的HPV型别已超过100型.由于HPV有这样大的异质性，所以传统的用于HPV基因分型的方法如使用HPV型特异性探针于原位杂交、点印迹杂交、South-ern印迹法、滤膜原位杂交，型特异引物扩增HPV序列，杂交(DNA-RNA)捕捉法等均需要将HPV常见的基因型逐个筛选，才能最后确定感染的HPV型别.而本研究所采用的改良的反向核酸杂交技术可以克服以上方法的不足，我们利用此技术对58例外阴白斑进行了HPV的检测以及基因分型.

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源

　　收集西安医科大学附属一院病理科、陕西省妇幼保健医院病理科、西京医院皮肤科、唐都医院皮肤科的石蜡包埋的外阴白斑组织标本共58例，其中增生型34例，萎缩型15例，混合型9例;尖锐湿疣标本20例;外阴鳞癌标本22例;发生在躯干部位的硬化萎缩性苔藓19例.

　　1.2 主要试剂

　　HPV16原型阳性质粒由山东医科大学分子生物学实验室于修平教授馈赠，HPV6，11，18，31，33原型阳性质粒由德国癌症研究中心E.-M.de Villiers教授提供;HPV通用引物及β-globin引物序列PC03/GH20由上海Sangon生物技术有限公司合成(Tab1);生物素化通用引物以及HPV6，11，16，18，31，33型特异性探针由北京赛百胜生物公司合成(Tab2);Taq DNA酶、dNTPs均系大连TaKaRa生物技术公司产品;反向杂交用膜为美国Pall Biosup-port公司的Biodynr C尼龙膜;辣根过氧化物酶标记的抗生物素及DAB显色系统购自华美生物公司;回收胶试剂盒购自上海华舜生物公司.

　　表1 PCR反应通用引物及对照反应引物序列(略)

　　Tab1 Sequences of the applied primers sets of PCR

　　1.3 HPV DNA提取

　　将10μm厚石蜡切片3张，裱于载玻片上常规烤片，二甲苯脱蜡后，切片自然干燥，用无菌刀片将组织刮入Ep管中，加入消化裂解液200μL及终浓度为200mg.L-1 的蛋白酶K，置37℃水浴过夜.次日煮沸灭活蛋白酶K，11000g离心10min.酚-氯仿抽提后，10μL上清液直接用作PCR模板.

　　表2 6条针对于6型HPV DNA的特异性探针序列(略)

　　Tab2 6sequence specific oligonucleotide probes against6types of HPV DNA

　　1.4 PCR扩增及再扩增

　　按照PCR标准反应条件，β-globin阳性的标本提取液(共58份)用于MY09/11的扩增.40μL PCR反应体系(1×PCR Buffer，1.5mmol?L-1 MgCl2 ，dNTPs各200μmol?L-1 ，MY09/11引物各0.5μmol?L-1 ，Taq DNA聚合酶2.5U，补足灭菌去离子水)中加入上述10μL HPV DNA提取液.反应条件为:94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃再延伸3min，共35个循环.

　　按照PCR反应设置对照组的原则，以原型HPV16重组质粒DNA为阳性对照，来检测PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论设计;阴性对照中:①选用正常人组织DNA代替模板DNA来作为标本(阴性)对照;②以灭菌去离子水代替模板DNA作为空白(试剂)对照.取10μL PCR产物，进行15g?L-1 琼脂糖电泳，检测扩增产物片段的大小.

　　将阳性电泳条带按照回收试剂盒说明书的步骤进行回收，然后取1μL回收产物作为新的模板，以生物素化引物(5'Bio-MY09/11)作为新的引物，反应参数更改为:94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，其他扩增条件不变，进行扩增生物素化的PCR产物，15g?L-1 琼脂糖电泳分析检测.

　　1.5 杂交膜的制备及反向杂交分析

　　将已合成的6种探针通过碳二亚胺的介导，固定在尼龙膜条上，膜的最上端为生物素化无关的DNA是作为阳性对照.将条带置于80℃烤箱中过夜，使探针完全固定在膜上，4℃封存.

　　膜条与预杂交液混合过夜.生物素化的PCR产物100℃变性10min，然后立即置于冰水混合物中5min，再与膜条过夜完成杂交.次日取出膜条洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素(Avidin-HRP)，最后进行DAB显色(Fig1).

　　统计学处理:结果用χ2 检验进行统计学分析.

　　图1 反向点探针杂交分析示意图(略)

　　Fig1 Sketch map for reverse hybridization blot probe assay

　　2 结果

　　2.1 琼脂糖凝胶电泳分析

　　将阳性质粒和石蜡标本的PCR扩增产物在15g?L-1 琼脂糖凝胶上电泳，可见这些产物的片段长度与预计的450bp基本相符(Tab3，Fig2).

　　表3 通用引物PCR扩增产物片段的大小以及起始和终止的碱基位置(略)

　　Tab3 Size of GP-PCR products and the initiation and termi-nation position in the respective whole sequences HPV Types

　　图2 外阴白色病变组织HPV DNA的通用引物PCR扩增结果(略)

　　Fig2 Agarose gel analysis of the GP-PCR products of HPV DNAs from vulvar leukoplakia samples

　　2.2 反向点探针杂交法分析结果

　　标本经PCR扩增后，实验组总阳性率为37.9%(22/58)，进行反向杂交分析，部分结果见Fig3.在实验组标本中，增生性营养不良(hyperplastic dystrophy)阳性率为35.3%(12/34)、萎缩性营养不良(lichen sclerosus et atrophicus of vulva)为40.0%(6/15)、混合性营养不良(mixed dystrophy)为44.4%(4/9);对照组中，发生在躯干的硬化萎缩性苔藓(lichen sclerosus et at-rophicus)阳性率为5.3%(1/19)、尖锐湿疣(condylo-ma acuminatum)为90%(18/20)、外阴鳞癌(SCC of vulva)Ⅰ级为50%(5/10)，Ⅱ级为40%(2/5)，Ⅲ级为28.6%(2/7)(Tab4).

　　图3 PCR-反向点探针杂交法分析HPV阳性外阴白斑患者感染的病毒类型(略)

　　Fig3 Genotype of HPVs in the patients with vulvar leuko-plakia by PCR-reverse hybridization blot probe assay

　　实验组与硬化萎缩性苔藓(躯干)组以及尖锐湿疣组相比，均有统计学意义(χ2 =5.8150，P<0.05;χ2 =14.1218，P<0.01)，而实验组与外阴鳞癌组相比，没有统计学意义(P>0.05)实验组中的增生型与尖锐湿疣组的HPV感染率的差异、萎缩型与硬化萎缩性苔藓(躯干)组的HPV感染率均有显著的统计学意义(χ2 =13.1278，P<0.01;χ2 =4.2442，P<0.05，Tab5).

　　2.3 外阴白斑与HPV型别的关系

　　实验组中，良性型别占45.5%(10/22)，恶性型别占54.5%(12/22).对照组的硬化萎缩性苔藓(躯干)组、尖锐湿疣组、外阴鳞癌组中良性型分别占0%(0/1)、100%(18/18)、11.1%(1/9)，恶性型分别为100%(1/1)，0%(0/18)，88.9%(8/9)(Tab4).

　　表4 外阴白斑组织及对照组中HPV的基因型检测结果(略)

　　Tab4 Genotype of HPVs detected in the vulvar leukoplakia patients and the controls

　　表5 实验组与对照组HPV总感染率的χ2 统计检验(略)

　　Tab5 χ2 analysis between the tested group and the control

　　实验组中增生型及混合型与对照组的尖锐湿疣中良、恶性HPV感染率的差异有一定的统计学意义(χ2 =4.3389，P<0.05，χ2 =4.7743，P<0.05)，而与外阴鳞癌组比较，二者的差异不显著.实验组中的硬化萎缩型与外阴鳞癌组的感染率的差异，经统计学分析不显著(P>0.05，Tab6).

　　表6 实验组与对照组良、恶型HPV感染率的χ2 统计检验(略)

　　Tab6 χ2 analysis of benign and malignant HPVs between tested and control group

　　3 讨论

　　3.1 反向点探针杂交

　　我们参考Kleter等[6] 的线性探针反向杂交法(LiPA)以及Xu等[7] 的反向点杂交法(RDB)将HPV6，11，16，18，31，33等6条探针按照一定的浓度固定在尼龙膜上，制备成杂交膜，按照摸索的条件建立了改良的反向点探针杂交法(re-verse hybridization blot probe assay).这种方法的优点在于:①将多种探针固定在同一条膜上，同时参与检测样品DNA，不必担心探针之间互补结合而相互干扰，故能一次性筛查多种不同的序列，克服了传统的杂交法一次只能检测一种未知序列的局限性.②采用生物素标记引物，应用安全可靠.③此法敏感性高，实验中，我们使用每点50～100ng的探针浓度，1.0～2.5mg?L-1 的Avidin-HPR浓度即可得到满意的金黄色杂交点结果.

　　3.2 外阴白斑与HPV的关系

　　目前文献报道，HPV感染是引起下生殖道上皮性肿瘤及癌前病变的重要因素之一.本实验对58例外阴白斑组织进行了HPV检测，总检出率为37.9%.以前外阴鳞癌中HPV-DNA检测的文献[8]，阳性率在0～80%，平均52%，而我们检测的外阴鳞癌标本阳性率(40.9%)低于文献报道的平均水平.这可能与前人多是使用新鲜或冰冻标本，而我们使用的是甲醛固定、石蜡包埋组织有关.

　　经统计学分析，实验组与硬化萎缩性苔藓(躯干)组以及尖锐湿疣组相比，均有统计学意义(χ2 =5.8150，P<0.05;χ2 =14.1218，P<0.01)，提示HPV在白斑组中的致病机制与在硬化萎缩性苔藓(躯干)组和尖锐湿疣组中的显著不同.而实验组无论与总外阴鳞癌组相比，还是分别与外阴鳞癌Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级相比，均无统计学意义(P>0.05)，提示HPV在白斑组中的致病机制与在外阴鳞癌中的差异不显著，这一点支持外阴白斑可能是一种癌前病变的理论.实验组中的增生型与尖锐湿疣组的HPV感染率的差异、萎缩型与硬化萎缩性苔藓(躯干)组的HPV感染率均有显著的统计学意义(χ2 =13.1278，P<0.01;χ2 =4.2442，P<0.05)，以上这些均表明在外阴白斑的发生机制中，HPV所起的作用与在良性病损中的不同.

　　3.3 外阴白斑与HPV型别的关系

　　HPV目前已被发现有20余型与人的皮肤、粘膜病损相关，其中HPV6，11，16，18，31，33型与生殖区病损相关.流行病学及临床的研究表明，HPV6和HPV11是导致生殖区良性疣状病变的常见型别[9] ，而HPV16和HPV18是常见的生殖系统高危致癌型别[10] ，HPV31，33型也与癌形成有关，但发病率低，为中危型[11] .因此，HPV的分型，对于生殖区癌的预防、早期发现及愈后监测具有重要意义.

　　本实验中，我们将HPV划分为良性型别(HPV6，11，6/11)和恶性型别(HPV16，18，31，33)进行病毒型别的分析.实验组中，良性型别占45.5%，恶性型别占54.5%.实验组中增生型及混合型与对照组的尖锐湿疣中良、恶性HPV感染率的差异有一定的统计学意义(χ2 =4.3389，P<0.05，χ2 =4.7743，P<0.05)，而与外阴鳞癌组比较，二者的差异不显著.这些说明实验组的增生型及混合型病变其性质是界于良性与恶性病变之间的.实验组中的硬化萎缩型所检测出的HPV型别均为恶性型，而其与外阴鳞癌组的感染率的差异，经统计学分析不显著，提示硬化萎缩型有向恶性转变的可能.

　　实验证明反向点探针杂交法是用于检测并分型HPV-DNA的有效的和敏感的技术，特别是对于石蜡包埋的组织.外阴白斑中HPV-DNA的总阳性率为37.9%.良性型(HPV6，11，6/11)、恶性型HPV(HPV16，18，33)可能协同其他因素在外阴白斑的发生过程中起重要作用.

　　致 谢

　　西京医院皮肤科高天文主任、陕西省妇幼保健院病理科张瑜主任、西安医科大学附属一院病理科苏宝山教授在标本采集方面给予支持;美国国家癌症协会Patti Gravitt博士、第四军医大学基础部生物化学教研室张小光博士在实验设计上给予指导;第一军医大学基础部生物化学教研室徐钤教授、荷兰奈梅亨大学Willem JG Melchers博士、山东医科大 学分子生物学实验室于修平教授、卞继峰博士在实验方法改进方面给予帮助.

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