Smad4在胃癌组织中表达的研究

　　【摘要】 目的 检测Smad4在胃癌组织及其相应正常胃粘膜组织中的表达分布，并分析其与胃癌患者临床病理学特征之间的关系。方法 选取39例经外科手术切除及组织病理学证实的胃癌患者癌组织标本及相应正常胃粘膜组织，应用冰冻切片免疫组化染色方法，在蛋白水平进行检测。结果 正常胃粘膜细胞浆中都有Smad4阳性表达，39例胃癌患者癌组织中22例有Smad4阳性表达(56.4%)，两者之间差异有显著性(P<0.05)。Smad4蛋白的表达与癌细胞的分化程度及浸润程度相关，分化程度越低、浸润程度越重，其阳性表达率越低(P<0.05);而Smad4蛋白的表达与年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移、远处转移无相关性。结论 Smad4的表达下降与胃癌的发生有关，而且与癌细胞的分化程度及浸润程度密切相关，Smad4可能作为胃癌诊断和预后的分子标志。

　　【关键词】 胃癌;Smad4;免疫组织化学

　　Study of expression of Smad4 in gastric carcinoma tissueCHEN Ping,ZHANG Li, SONG Yanping, LI Fukang, LIN Jing

　　(Medical College of Qingdao University, Qingdao 266000,China)

　　Abstract:Objective: To detect the expression and disposition of Smad4 in the gastric carcinoma tissue and the corresponding normal mucosal tissue, and to analyze the relations between the expression, disposition and the clinicopathologic characteristics. Methods: Thirty-nine cases of gastric cancer and normal tissues confirmed by histopathology were selected to detect Smad4 and compared by frozen section immunohistochemistry staining technology. Results: Smad4 had positive expression in all the normal gastric mucosal tissues, and 22(56.4%) cases had positive expression in the 39 cases gastric carcinoma tissue, there were statistical significances between the normal gastric mucosal and gastric cancer tissue groups(P<0.05).Smad4 expression had correlations with the gastric cancer cell differentiation and the depth of invasion, while the Smad4 expression had no marked correlations with the age of patients, gender, the TNM staging, lymph node metastasis, distant metastasis. Conclusion: Reduced expression of Smad4 is correlated with the pathogenesis of gastric carcinoma, and closely correlated with the gastric cancer cell differentiation and the depth of invasion.Smad4 appears to be a molecule marker in the gastric cancer diagnosis and prognosis.

　　Key words:gastric carcinoma;Smad4;Immunohistochemisty

　　胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生机制的研究集中于癌基因、抑癌基因的突变和错配修复[1]。转化生长因子β( transforming growth factor beta, TGFbeta)信号传导发生障碍，引起包括自身免疫疾病、肿瘤等许多疾病[2]。近来关于线虫、果蝇属基因研究显示Smad 蛋白参与是TGFβ族信号转导的枢纽[3]。按照不同作用机制Smad 蛋白分为三类，受体控制型(receptorregulated Smads, RSmads:Smad1,2,3,5,8)，共有型(common mediator Smads, CoSmads:Smad4 )，抑制型(inhibitory Smads , ISmads:Smad6,Smad4)[4]。编码Smad4基因位于染色体18q21，是肿瘤抑制基因DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4)[5]，其缺失或突变常导致胰腺肿瘤[6];而其与胃癌发生发展关系的研究目前尚不多见，因此我们通过免疫组化的方法检测胃癌组织及其相应正常粘膜组织Smad4的表达，来分析Smad4与胃癌及其临床病理学间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本

　　收集2007年11月至2008年11月间泰安市中心医院普外科收住的胃癌手术患者39例，术前均未接受化疗和放疗，病理诊断明确。组织学诊断和分期按照国际抗癌联盟制定的TNM分类标准。为了将所研究的Smad4分子与胃癌患者临床病理学特征进行比较，患者被分为两组，详细情况见表1。手术切除后立即收集肿瘤组织标本和相应的正常胃粘膜组织(距瘤组织5cm以上)放入液氮中冷冻保存，用于冰冻切片免疫组化染色。

　　1.2 方法

　　胃癌组织中Smad4的免疫组化染色 连续冰冻切片厚4 μm,免疫组化染色采用生物素链亲和素过氧化物酶法(ABC法)。含有3%过氧化氢的冰甲醇溶液封闭内原性过氧化物酶反应15分钟，非特异性的抗体结合用羊血清(武汉博士德生物公司)封闭30分钟，抗 TGFbeta(武汉博士德生物公司)及抗Smad4(武汉博士德生物公司)单克隆抗体分别孵育切片，(抗体稀释度1∶100，4°C过夜)。已结合的抗体用DAKO公司生产的超敏检测试剂盒(DakoCytomation,Copenhagn,Denm ark,K5001)检测，DAB 显色后，苏木素复染。用PBS 和正常鼠的不相关抗体分别代规一抗和二抗作为阴性对照。(3)结果判断：免疫染色结果采用Remm ele W.半定量记数的方法，由两位独立的不知道组织学结果的病理医师在光镜下进行免疫染色结果判定。具体记数方法如下：IRS=SI×PP，SI染色强度，分为4个等级：0为阴性，1为弱阳性，2为中度阳性，3为强阳性;PP阳性细胞百分率，无阳性染色为0，<10%为1，10%～50%为2，51%～80%为3，>80%为4;IRS的乘积为～12，当积分>2时被判为阳性染色(其中3～6分是中度阳性，>6为强阳性染色)。TGFβ1和Smad4特异性阳性染色定位于胞浆和胞膜，呈棕黄色染色颗粒。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计分析软件处理数据。胃癌组织和正常胃粘膜组织中Smad4阳性表达及其与胃癌患者临床病理学特点之间的关系分析均采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 胃组织标本中Smad4蛋白的表达

　　正常胃粘膜细胞浆中都有Smad4阳性表达，呈现中度和强阳性染色。Smad4在胃癌组织中的阳性表达明显低于正常胃粘膜组织，两者之间差异有显著性(P<0.05)。39例胃癌患者癌组织中22例有Smad4阳性表达(56.4%)(图1)。

　　2.2 Smad4蛋白的表达与临床病理间的关系(见表1)表1 胃癌组织中Smad4的表达与胃癌患者临床病理学参数之间的比较

　　Smad4蛋白的表达与癌细胞的分化程度及浸润程度相关，分化程度越低、浸润程度越重，其阳性表达率越低(P<0.05);而Smad4蛋白的表达与年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移、远处转移无相关性。

　　图1 Smad4在胃癌组织中的表达 ×200

　　3 讨 论

　　目前已知多种肿瘤细胞过度表达TGFβ，报道较多的是肿瘤细胞耐受TGFβ介导的生长抑制，表现为TGFβ受体改变、下游信号Smads突变及癌基因突变等。肿瘤细胞因此失去对TGFβ的反应性，细胞增殖与凋亡失去平衡。通过刺激血管生成、细胞播散、免疫抑制及合成细胞外基质等提供适宜肿瘤生长、浸润及转移的微环境[7]。Smad4是Smads家族的主要成员之一，TGFβ通路中的Smad2/Smad3复合物只有与Smad4结合后才能发挥其调节基因转录从而抑制细胞生长的作用。

　　Smad4基因是18q杂合性缺失的靶基因之一。Smad4的杂合性缺失常发生于肿瘤的进展期，在肿瘤细胞获得和转移潜能时，其杂合性缺失的频率明显增加[8];有研究表明，Smad4的表达与一些恶性肿瘤发生发展、生物学行为及其预后有着密切关系，与阴性表达者比较，阳性表达者多分化好、生长速度慢和不易发生转移，因而预后较好[9];在其他消化道肿瘤中，Smad4的表达也有减少[10，11]。我们研究发现，Smad4在胃癌组织中的阳性表达率为56.4%，明显低于正常胃粘膜的100%(P<0.05);而且在胃癌组中分化型、浸润深度T1组也明显高于未分化型和T2、T3、T4组。Xiangming 等[12]研究也表明，Smad4蛋白表达下降与胃癌细胞的浸润深度密切相关，并且那些出现了表达下降的胃癌患者往往预后不佳。

　　这提示Smad4的表达与胃癌的发生发展有关，它可能是一个重要的抑癌基因，而且与胃癌细胞的组织分化及浸润程度有关。而作为TGFβ信号通路中的重要调控因子，Smad4可能会成为研究肿瘤发生发展的新的靶分子，是一个有利于肿瘤检测、治疗评估和预后的指标。

　　【参考文献】

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　　[11] Fukuchi M,Masuda N,Miyazaki T,et al.Decreased Smad4 expression in the transforming growth factorbeta signaling pathway during progression of esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer,2002,95:737743.

　　[12] Xiangming C, Natsugoe S, Kuroshima K, et al. Preserverd Smad4 expression in the Transforming growth factor beta signaling pathway is a favorable prognostic Factor in patients with advanced gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2001,7:277282.