ACE siRNA对人脐静脉内皮细胞ET1表达的影响

　　【摘要】 　　目的:观察小干扰RNA(siRNA)对人脐静脉内皮细胞CRL1730血管紧张素转换酶(ACE)mRNA与蛋白表达的作用及对内皮素1(ET1)表达的影响。方法:设计3条针对人ACE基因的siRNA，脂质体转染CRL1730细胞，RTPCR检测ACE mRNA的表达，ELISA法检测ACE蛋白含量;并比较ACE siRNA与卡托普利(Captopril)对血管紧张素II同步处理6、12、24 h 后CRL1730细胞ET1的表达。 结果:ACE siRNA能够抑制ACE mRNA及蛋白表达，以48 h为甚(mRNA水平下调71.01%;蛋白水平下调68.13%，均P<0.01)。ACE siRNA和Captopril均能抑制CRL1730细胞ET1表达(P<0.05)，ACE siRNA抑制作用优于Captopril(P<0.05)。结论:ACE siRNA能有效下调ACE的表达，并抑制血管紧张素II诱导的ET1表达。

　　【关键词】 小干扰RNA 人脐静脉内皮细胞 血管紧张素转换酶 血管紧张素II 内皮素 1

　　Effects of ACE siRNA on the Expression of Endothelin1 in Human Umbilical Vein Endothelial Cells YANG Yong1,2,WANG Wei2,HUANG Congxin1*,ZHOU Ming2,FANG Zhicheng2,HE Chaorong2 (Department of Cardiology,1Renmin Hospital,Wuhan Unviersity,Wuhan,Hubei 430060;2Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To observe the effects of ACE siRNA on the expression of angiotensin converting enzyme mRNA in human umbilical vein endothelial cells CRL1730 and the expression of endothelin1.Methods Three siRNAs targeted against ACE gene were designed and synthesized,transfected into CRL1730 with liposome,the expression of ACE mRNA and protein was detected with RTPCR and ELISA, respectively.The expression of endothelin1 stimulated with angiotensin Ⅱand ACE siRNA or captopril at the time point of 6 h,12 h and 24 h were compared.Results The expression of ACE mRNA and protein could inhibited with ACE siRNA,and reached the peak at 48 h(mRNA decreased 71.01%,P<0.01;protein decreased 68.13%).ACE siRNA and captopril all could inhibit the expression of ET1 in CRL1730 cells(P<0.05),and the effect of ACE siRNA was better than that of captopril (P<0.05).Conclusion RNA interference could effectively downregulate the expression of ACE and inhibit the expression of ET1 induced with angiotensinⅡ.

　　Keywords:Small interfering RNA;Human umbilical vein endothelial cells;Angiotensin converting enzyme;Angiotensin II;Endothelin1

　　高血压基因治疗比传统药物能更持续的控制血压，显著改善高血压导致的靶器官损害，为高血压治疗开辟了新的研究领域[1]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默，其沉默效应及稳定性优于反义寡核苷酸，现已成为基因沉默技术的主要手段[2]。本研究观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)基因与蛋白水平的调控作用以及对内皮细胞内皮素1(endothelin1,ET1)的影响，为RNAi技术在高血压基因治疗领域中的应用提供治疗靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人脐静脉内皮细胞株(ATCC编号：CRL1730)购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。siRNA由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。LipofectamineTM 2000、Trizol试剂(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(立陶宛Fermentas公司);ACE ELISA Kit、ET1 ELISA Kit(美国R&D Systems公司);血管紧张素II(Angiotensin II,AngII;Sigma公司)。卡托普利标准品(Captopril，石家庄岩峰医药科技有限公司);细胞裂解液(含50 mmol/L Tris·HCl,0.15 mmol/L NaCl,1% Triton X100,1% CHAPS，用前加入PMSF)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 siRNA靶点序列和PCR引物序列:根据siRNA设计原则[3]，针对人ACE mRNA序列(Genbank编号:NM-000789.2)，设计三条siRNA，siRNA1针对于2739～2757位点：5′CCACAGAGGCTATGCTAAA3′，siRNA2针对于3261～3279位点：5′GCATCACCAAGGAGAACTA3′,siRNA3针对于2083～2101位点：5′GCAG AAGAACATGCAAATA3′，同时合成阴性对照序列(NC control)并于5′端加FAM荧光基团;经BLAST工具分析这些序列与人其他基因无明显同源性。内参GAPDH引物序列：上游5′ CAAGGTCATCCATGACAACTTTG3′,下游5′GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG3′，扩增片段为496 bp。ACE引物序列：上游5′GTTTGTGGAGGAATATGACCG3′,下游5′CCTTCTTTATGATCCGCTT G3′，扩增片段为218 bp。

　　1.2.2 转染效率测定：3.0×105个/mL密度接种细胞于6孔板，用不含抗生素的10%胎牛血清DMEM培养液培养12 h，细胞融合至30%～50%进行转染。每孔加入6.0 μL NC control(总量120 pmol，培养液终浓度60 nmol/L)与4.0 μL LipofectamineTM2000，按照LipofectamineTM 2000说明书操作进行转染。转染后12 h于荧光显微镜下蓝光480 nm波长激发荧光，计算3个不同视野下绿色荧光细胞数与自然光下总细胞数的百分比，取其平均值为转染效率。

　　1.2.3 ACEsiRNA筛选和ACE mRNA、ACE蛋白表达检测：分为5组，每组复3孔;分别为siRNA1组，siRNA2组，siRNA3组、阴性对照组(NC control)与空白对照组(control)。接种细胞后，前4组使用与1.2.2相同的剂量与方法转染入相应siRNA，空白对照组不作处理，转染后48 h与72 h RTPCR法检测ACE mRNA表达，ELISA法检测ACE蛋白的表达。

　　Trizol法提取细胞总RNA，取1 μg按照试剂盒说明书合成cDNA并作为模板行PCR扩增，以GAPDH为内参。PCR 反应条件： 94 ℃变性3 min,94 ℃退火30 s,58 ℃(GAPDH退火温度) 30 s,72 ℃延伸1 min，循环 32次，最后72 ℃ 延伸10 min。ACE退火温度为 53 ℃，循环35次，余条件相同。产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统摄像分析。用ACE的条带灰度值与GAPDH的条带灰度值之比代表ACE相对含量。细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，按照ELISA试剂盒说明书操作检测ACE蛋白。

　　1.2.4 ACEsiRNA对内皮素1表达影响：使用1.2.3筛选的有效siRNA进行实验。细胞分为4组，每组复6孔:分别为空脂质体对照组(control)，AngⅡ组，siRNA组，captopril组。4组均加入2.0 μL/孔 LipofectamineTM 2000，siRNA组同时加入3 μL siRNA(培养液终浓度60 nmol/L)进行转染操作。转染完成后培养至24 h，除control组外，其余3组换用含10-7mol/L AngⅡ的DMEM高糖培养液，captopril组同时加入captopril至终浓度为10-7mol/L。换液前及换液加药处理后6、12、24 h取各孔培养液上清100 μL，按ELISA试剂盒操作说明检测ET1含量。

　　1.3 统计学处理

　　数据采用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内前后比较采用配对t检验，以双侧P<0.05为有统计学差异，用SPSS 13.0统计软件包对数据进行分析。

　　2 结果

　　2.1 荧光转染效率测定

　　图2 RTPCR产物凝胶电泳图

　　注：M:DNA Marker，C:control，S1:siRNA1组，S2:siRNA2组，S3:siRNA3组NC:NC control 组。218 bp处为ACE条带，496 bp处为GAPDH条带。

　　荧光显微镜下可见被转染入FAM荧光的细胞呈点状分布(图1)，转染效率为65.97%。

　　2.2 ACEsiRNA对ACE mRNA表达的作用

　　与control组对比，siRNA2组48 h和72 h ACE mRNA的表达均下调(P<0.01)，以48 h为甚(P<0.05)，下调比例达到71.01%;siRNA1组与siRNA3组转染后72 h ACE mRNA 表达无统计学差异(P>0.05);阴性对照组均未见明显抑制作用(P>0.05)，见图2。

　　2.3 ACE siRNA对ACE蛋白表达影响

　　与control组对比，siRNA2组48 h及72 h ACE蛋白表达均显著下调(P<0.01)，以48 h最为明显(P<0.05)，下调比例达到68.13%;siRNA1组仅48 h有抑制作用(P<0.05)。siRNA3组与NC control组均无明显抑制作用(P>0.05)，见图3。

　　2.4 ACE siRNA对CRL1730细胞ET1表达的影响

　　从6 h起，Ang II能促进CRL1730细胞ET1表达，12 h达高峰(P<0.01);6 h至12 h，ACE siRNA和captopril 均能抑制ET1表达(P<0.05);ACE siRNA抑制作用优于captopril，从12 h一直持续到24 h(P<0.05)，见表1。 注：与空白对照组比较#P<0.01，▲P<0.05，表1 ACE siRNA对CRL1730细胞ET1表达的影响注：AngII组组内比较：与加药前与加药12 h比较▲P<0.01，与加药后24 h比较△P<0.05;siRNA组与AngII组比较，※P<0.05;#P<0.01，captopril组与Ang II组比较，●P<0.05，*P>0.05;captopril组与siRNA组比较，☆P>0.05，★P<0.05

　　3 讨论

　　RNAi技术已广泛用于高血压病、高脂血症、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、心肌病等多个领域，显示出其在心血管疾病基因治疗中的巨大潜力[4]。高血压患者血浆及组织ACE的活性增强，促进Ang I分解成为Ang II，降解缓激肽、Ang(17)肽等可拮抗Ang II作用的细胞因子，诱导内皮细胞ET1表达增加，维持血压的持续升高，导致血管内膜增殖与动脉粥样硬化斑块形成，在高血压的病理生理过程有着重要作用[5]。利用RNAi技术可沉默ACE，进而可能控制血压及改善高血压导致的靶器官损害。

　　siRNA 作用于mRNA 的不同区域产生的沉默效能并不相同，因此在进行RNAi研究时必须设计多个序列进行筛选[6]。采用化学合成的siRNA进行RNAi研究，相对于构建质粒及病毒载体而言具有合成简便、费用相对低廉的优点，适合于快速筛选有效序列。本研究采用脂质体转染方法，将携带FAM荧光的siRNA成功转染CRL1730细胞，效率可达65.97%;且人ACE mRNA 3 2613 279位点的siRNA能够在培养液终浓度为60 nmol/L的条件下显著抑制细胞ACE mRNA与蛋白的表达。而Morishita等[7]使用脂质体转染的方法，需要3 μmol/L的反义寡核苷酸才能够有效抑制ACE的活性;Miyagishi等[8]研究也发现针对相同的基因进行沉默时，siRNA达到半数抑制率所需要的浓度比反义寡核苷酸的浓度要低100～10 000倍。

　　RNAi诱导基因沉默时，首先将双链RNA分解成为21～23 nt长度的siRNA;siRNA的反义链与核酸内切酶Dicer酶、反式RNA结合蛋白结合，形成具有剪切靶mRNA作用的诱导沉默复合体，进而特异性降解靶mRNA，减少转录后mRNA向蛋白的翻译[2]。本研究发现化学合成的ACE siRNA能够诱导ACE mRNA的降解，ACE蛋白的表达也随之降低;且在48 h能够达到最大的沉默效果，72 h则有所下降，与Chiu等[9]的研究结果相似。可能与哺乳动物细胞缺乏RNA诱导的RNA聚合酶，RNAi在细胞间不能传递与放大有关，也可能与siRNA经过细胞分裂及内源性核酸酶降解后被稀释有关。

　　本研究观察到Ang II能够增强CRL1730细胞ET1的表达，与Ang II增强ET1前体原mRNA 转录与表达、提高内皮素转化酶活性，刺激ET1合成有关[10]。Captopril和siRNA均能够抑制由Ang II诱导的ET1表达;captopril与ACE蛋白活性中心结合抑制其活性，siRNA则通过降解ACE mRNA直接下调ACE蛋白的表达。两者均能够减少由ACE分解Ang I产生的Ang II，促进血管紧张素转换酶2将Ang II降解成为Ang (1-7)肽，拮抗Ang II的作用[11];同时减少缓激肽降解，与内皮细胞的缓激肽β2受体作用减少ET1的表达;还能够降低内皮细胞氧自由基的活性，增加NO合成，减少ET1的释放[12]。进一步研究发现，siRNA能够持续抑制ET1表达，抑制作用比卡托普利强，其机制可能为卡托普利具有抑制ACE活性作用的巯基极易发生氧化，有效作用浓度不断降低;而导入细胞内的siRNA对ACE蛋白表达的下调作用相对稳定。利用ACE siRNA能够有效稳定的下调内皮细胞ACE的表达，以调节Ang II诱导的内皮细胞ET1的表达，可作为研究高血压基因治疗的工具进行深入研究。

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