RNA干扰抑制Survivin表达对人喉癌细胞药物敏感性的影响

　　【摘要】 　　目的：探讨RNA干扰技术抑制Survivin基因表达对增强人喉癌HEP2细胞化疗药物敏感性。方法:针对Survivin mRNA序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pRNATSurvivin重组表达载体，转染人喉癌HEP2细胞;通过RTPCR和Western blot分析其对HEP2细胞内源性Survivin表达的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察HEP2细胞对化疗药物5FU和优福定敏感性的改变。结果:成功构建pRNATSurvivin重组质粒,并成功转染HEP2细胞;RTPCR和Western blot结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Survivin基因表达(P<0.01);MTT及流式细胞仪结果证明在5FU和优福定联合作用下，pRNATSurvivin组HEP2细胞的生长抑制率明显增高(P<0.01)。结论:pRNATSurvivin可抑制Survivin在人喉癌HEP2细胞中的表达,并增强HEP2细胞对化疗药物敏感性。

　　【关键词】 Survivin RNA干扰 喉癌 药物敏感性

　　Effect of Inhibited Expression of Survivin by RNA Interference on the Drug Sensitivity in Human Laryngocarcinoma Cells CHEN Xiangjun,YU Zizhong,LI Guoyi* (Department of Otolaryngology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To explore the effect of inhibited expression of survivin by RNA interference on sensitivity of HEP2 cells to chemotherapeutic drugs. Methods One pair of DNA template coding siRNA was designed and synthesized against Survivin mRNA sequence,the pRNATSurvivin recombinant expression vector was constructed and transfected into HEP2 cells.The effect of endogenous survivin expression in HEP2 cells by RNA interference was analyzed with RTPCR and Western blot.The changes of sensitivity to 5FU and UFT in HEP2 cells were observed with MTT.Results Recombinant plasmid pRNATSurvivin was constructed and transfected into HEP2 cells successfully,recombinant plasmid pRNATSurvivin could significantly inhibit the expression of Survivin in HEP2 cells (P<0.01),which was demonstrated by RTPCR and Western blot.The growth inhibitory rate of HEP2 cells in pRNATSurvivin group was significantly increased under the combined effect of 5FU and UFT(P<0.01),which was demonstrated by MTT and flow cytometry. Conclusion pRNAT Survivin could inhibit the expression of Survivin,enhance the sensitivity of HEP2 cells to chemotherapeutic drugs.

　　Key words: Survivin;RNA interference;Laryngocarcinoma;Sensitivity

　　应用化学药物或γ射线治疗是目前常见的肿瘤术后治疗手段。而逃避凋亡是肿瘤发生、发展和药物抵抗的重要机制[1]。如何能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并诱导其凋亡就成了目前在肿瘤治疗上非常重要的研究课题之一。Survivin是人体基因组中一种重要的肿瘤特异性基因，它明显抑制肿瘤细胞凋亡并在促进癌细胞生长中起重要作用[2]。本实验通过RNA干扰技术抑制人喉癌细胞Survivin的表达,并检测干扰后肿瘤细胞HEP2对化疗药物敏感性的改变,探讨Survivin对人喉癌细胞化疗药物敏感性的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养

　　人喉癌HEP2细胞购于上海中科院细胞所,置于10%新生小牛血清RPMI1640培养基中,内加青霉素1×105 U/mL，链霉素100 mg/mL，5%CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱内培养。

　　siRNA真核表达载体的构建：具有互补序列能够编码短发卡RNA(shRNA)的双链寡核苷酸模板DNA由上海康成公司合成。其转录产物所形成的siRNA的作用靶点为人Survivin mRNA 94-112位核苷酸(GeneBank NO:NM001168)。干扰序列为: TTCAAGAGA,AAGAACTCT;阴性对照是双链寡核苷酸转录产物所形成的siRNA，此序列不与任何人类基因序列同源。

　　1.2 实验分组及细胞转染

　　实验分为4组：空白对照组，未转染脂质体组(转染液中仅含脂质体无siRNA),阴性对照组(转染液加入空质粒pRNATNegative),pRNATSurvivin组(转染液加入重组pRNATSurvivin质粒)。将人喉癌HEP2细胞分4组用LipofectinTM2000(美国Invitrogene公司)介导进行转染。

　　RTPCR检测HEP2细胞中Survivin mRNA的表达：分别收集转染24、48、72 h细胞，使用Trizol (美国Invitrogene公司) 提取细胞总RNA,步骤按说明书。RTPCR法检测在siRNA干预下Survivin基因mRNA表达的改变。引物上游序列为：5′GGC ATGGGTGCCCCGACGTT3′;下游为：5′AGAGGCCTCAATCCATGGCA3′。以Survivin与βactin条带的积分吸光度(A)比值表示Survivin mRNA的相对含量。

　　1.3 Western blot检测Survivin蛋白的表达量

　　收集细胞，细胞裂解液处理细胞，离心后取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，聚丙烯酞胺凝胶电泳，将蛋白电转至硝酸纤维膜上，与Survivin抗体(美国SantaCruz公司)结合，之后用辣根过氧化物酶结合的二抗结合，ECL法显色后照相。最后以imageproplus 4.5图像分析系统测定各条带灰度值,以此反映Survivin蛋白的表达程度。

　　1.4 MTT法检测化疗药物对各组细胞的生长抑制

　　分别取pRNATSurvivin组、阴性对照组、空白对照组的对数生长期细胞接种于96孔培养板内，每孔加入细胞1×104个，24 h后加入含抗癌药物的完全培养基,分别加入5FU(美国Sigma公司，1、4、8 μg/mL)或优福定(广州市振康医药有限公司，1、4、8 μg/mL) ,每组设3个复孔,继续作用24 h,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)继续培养4 h,弃去培养液,加入DMSO 150 μL,酶标仪测定570 nm处吸光度(A)值。根据3孔平均A值计算细胞生长抑制率(%) = (1-A实验组/A对照组)×100%。

　　1.5 统计学方法

　　使用SPSS 11.5软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为有统计学意义。2 结果

　　2.1 Survivin siRNA转染HEP2细胞后对Survivin mRNA表达的影响

　　pRNATSurvivin组309 bp处的条带亮度显著低于其余各组(图1)，pRNATSurvivin组在24、48、72 h mRNA表达抑制率分别为67.15%、75.13%和75.43%，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)，且其抑制作用随处理时间延长而呈增长趋势。

　　2.2 Survivin siRNA转染HEP2细胞后对Survivin蛋白表达的影响

　　pRNATSurvivin组转染24、48、72 h后Survivin表达抑制率分别为63.15%、77.76%、79.27%，与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01，图2)。

　　2.3 Survivin siRNA对HEP2细胞药物敏感性的影响

　　pRNATSurvivin转染HEP2细胞后不同浓度的5FU和优福定的生长抑制率明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)，而空白对照组和阴性对照组的生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。表1 MTT法检测Survivin siRNA对HEP2喉癌细胞药物敏感性的影响

　　3 讨论

　　化疗在喉癌的综合治疗中占有重要地位,多药耐药是影响治疗效果的主要原因之一[3-4]。如何克服肿瘤化疗耐药性是值得深入研究的课题。研究表明,化学药物所致细胞毒作用的终末效应均为诱导细胞凋亡[5],抗肿瘤药物的疗效主要取决于其激活细胞凋亡的能力[6],由于肿瘤细胞常存在凋亡信号转导途径缺陷,导致许多肿瘤对化疗药物产生耐受[5]。因此,通过活化凋亡信号关键分子而促进细胞凋亡,为提高肿瘤化疗敏感性提供了新思路。

　　Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中一类抑制凋亡，调节细胞分化调节因子[2]。目前已有研究发现在胃腺、乳腺等高度恶性转移性肿瘤中Survivin过度表达[7],在一些喉癌细胞系中也有证据证明Survivin呈高度表达[8]。因此抑制Survivin在恶性肿瘤中的高度表达成为增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的关键所在。

　　RNA干扰技术是通过小的双链RNA高效、特异的阻断体内特定基因的表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失表达的技术，是目前沉默某些致病基因功能的有效手段。本实验通过构建针对Survivin基因的siRNA真核表达载体转入人喉癌HEP2细胞中。结果显示：阴性对照序列表达载体转染HEP2细胞后对Survivin表达无影响;而pRNATSurvivin转染HEP2细胞后显著抑制了Survivin的mRNA及蛋白表达(P<0.01)，其中 pRNATSurvivin组中 Survivin mRNA表达水平比空白对照组最多下降了75.43%，而蛋白表达量比空白对照组最多下降了79.27%，提示本研究构建的siRNA真核表达载体的确能够在细胞内持续地表达siRNA，高效、特异的抑制Survivin基因的表达。本实验通过MTT法检测转染前后化疗药物抑制细胞生长的情况表明:稳定转染Survivin siRNA 真核表达载体后5FU、优福定对细胞生长抑制作用增加。其中在转染Survivin siRNA和5FU联合作用下细胞生长抑制率最高达到(67.71±4.58)%，转染Survivin siRNA和优福定联合作用下细胞生长抑制率最高达到(74.54±4.43)%，相比未转染Survivin siRNA的空白对照组和阴性对照组有明显提高(P<0.01)。以上研究结果显示：用RNA干扰技术抑制Survivin表达造成肿瘤细胞对化疗药物的耐受性降低。

　　过表达Survivin可能并非激活肿瘤细胞化疗药物耐受性和抗凋亡能力所必需,但抑制Survivin表达可作为有效的调控信号,提高肿瘤细胞化疗敏感性, 导致肿瘤细胞凋亡。本研究通过RNA干扰技术的应用为基于调控细胞凋亡的生物治疗与化疗联合治疗喉癌提供了新的实验依据。

　　【参考文献】

　　[1]Reed JC.Bcl2:prevention of apoptosis as a mechanism of drug resistance[J].Hematol Oncol Clin North Am,1995,9(2):451-473.

　　[2]Li F.Survivin study:what is the next wave?[J].J Cell Physiol,2003,197(1):8-29.

　　[3]Nishimura G,Tsukuda M,Mikami Y,et al.Efficacy of concurrent chemoradiotherapy for T1 and T2 laryngeal squamous cell carcinoma regarding organ preservation[J].Anticancer Res,2009,29(2):661-666.

　　[4]Rengan R,Pfister DG,Lee NY,et al.Longterm neck control rates after complete response to chemoradiation in patients with advanced head and neck cancer[J].Am J Clin Oncol,2008,31(5):465-469.

　　[5]Schmitt CA.Senescence, apoptosis and therapycutting the lifelines of cancer[J].Nat Rev Cancer,2003,3(4):286-295.

　　[6]Chen N,Chen CC,Lau LF.Adhesion of human skin fibroblasts to Cyr61 is mediated through integrin alpha 6 beta 1 and cell surface heparan sulfate proteoglycans[J].J Biol Chem,2000,275(32):24 953-24 961.

　　[7]Spaulding B,Pan D,Ghadersohi A,et al.Characterization of the 12C4 survivin monoclonal antibody and insight into the expression of survivin in human adult tissues[J].Histopathology,2006,49(6):622-633.

　　[8]Marioni G,D′Alessandro E,Bertolin A,et al.Survivin multifaceted activity in head and neck carcinoma:current evidence and future therapeutic challenges[J].Acta Otolaryngol,2009,25:1-6.