重组表达质粒pcDNA3/HIF1α的构建及其在人肝癌细胞株HepG2的稳定表达

　　【摘要】 　　目的:构建缺氧诱导因子(HIF1α)基因的表达质粒，经脂质体转染人肝癌细胞株HepG2，建立稳定表达HIF1α基因的细胞模型，为肝癌研究提供有效工具。方法:采用RTPCR方法扩增肝癌细胞株HepG2内HIF1α基因功能区片段，克隆至真核表达载体pcDNA3上，转染HepG2细胞后，经G418筛选，建立稳定表达HIF1α基因的细胞株，免疫荧光染色和Westernblot分析HIF1α蛋白的表达。结果:通过酶切鉴定，凝胶电泳分析，两条带大小分别位于5.3 kb和2.55 kb，与预期结果符合，序列测定证实HIF1α与GeneBank公布的序列一致。经脂质体包裹转染HepG2后，免疫荧光染色和Westernblot分析证实HIF1α蛋白的表达明显上调。结论:经脂质体途径成功构建稳定表达HIF1α的细胞模型，为肝癌研究提供了一个有效的工具。

　　【关键词】 HepG2 缺氧诱导因子 基因转染

　　Construction of pcDNA3/HIF1α Expression Plasmid and its Stable Expression in Liver Cancer Cell Line HepG2 ZENG Shaobo，ZHAO Yanmei,JIANG Bin,JIAN Zhiyuan,YAN Bin,LIU Jiong ( Department of Genernal Surgery,Taihe Hospital,Yunyang Medical College，Shiyan,Hubei 442000,Chian)

　　Abstract: Objective To construct the plasmid of HIF1α and transfect it into human liver cancer cell line HepG2 with liposome,to establish the cell model stably expressing HIF1α and provide an effective tool for liver cancer research.Methods The function region of HIF1α mRNA in HepG2 was amplified with RTPCR and subcloned into the vector pcDNA3,the cell lines that stably expressed HIF1α were selected with G418 pcDNA3/HIF1α after transfected into HepG2,the expression of HIF1α protein was detected with Western blot and immunofluorescence staining.Results The constructed expression plasmid was identified with restriction enzyme digestion and gel elecrrophoresis,two DNA bands at 5.3kb and 2.55kb were found,respectively, which was in accordance with expected results,the sequence of cloned HIF1α gene was the same as that reported in GeneBank.Eukaryotic expression plasmid was transfected into cultured HepG2 cells with liposome,the expression of HIF1α protein detected with Western blot and immunofluorescence staining was significantly increased.Conclusion HepG2 with stable HIF1α expression was successfully established,which may be an effective tool for liver cancer research.

　　Key word: HepG2;Hypoxiainducible factor1α;Gene transfection

　　HIF1(缺氧诱导因子，Hypoxiainducible factor1)是连接在EPO基因缺氧反应元件(hypoxiaresponse element，HRE)上的一个核因子，由α、β两个亚单位组成，其中HIF1α受缺氧或低糖调节，通过与靶基因特定序列DNA结合而调控其转录。这些基因包括血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)、NO合酶(NOS)、糖酵解相关酶等基因[1-2]，能使肿瘤尤其是乏氧肿瘤(如肝癌)更具有侵袭性而发生远处转移[3]。目前以HIF1α为药物靶点可望成为肝癌基因治疗的新途径，故建立一个稳定表达HIF1α的肝癌细胞株已成为进一步开展HIF1α在肝癌研究中的关键。

　　1 材料与方法

　　1.1 质粒、菌株及试剂

　　真核表达质粒pcDNA3、大肠杆菌DH5和肝癌细胞株HepG2购自武汉大学典型生物保藏中心。限制性内切酶BamH I和Xba I购自华美公司， T4连接酶、LipofectamineTM 2000、G418及引物合成购自Gibcol公司，逆转录酶MMLV、随机引物及Taq聚合酶购自Promega公司。鼠抗人HIF1α多克隆抗体购自San Cruze公司。

　　1.2 引物合成

　　使用Primer设计软件，根据人HIF1α序列[4]设计引物，两端分别引入BamH I和Xba l酶切位点。5′GCGGATCCAACGTCGAAAAGAAAAGTCTC G3′(sense),5′GCTCTAGAAAGTTTGTGCAGTATTGTAGCC3′(antisense),扩增片段大小为2.55 kb。

　　Trizol法提取HepG2细胞内总RNA，mRNA样本经逆转录反应合成HIF1α cDNA第1链，然后进行PCR扩增。反应条件：50 μL反应体系中各引物终浓度为0.1 μmol/L，dNTP各50 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，Taq酶2 μL。94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s ，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

　　1.3 质粒pcDNA3/HIF1α的构建

　　RTPCR扩增产物片段和质粒pcDNA3经BamH I和Xba I酶切后，凝胶回收试剂盒回收酶切片段，在T4连接酶的作用下4 ℃过夜;连接产物转化感受态细菌，置含Amp+的LB琼脂平板，37 ℃倒置过夜培养;挑选单菌落，直接菌落PCR方法扩增，挑选阳性克隆，小量制备质粒，酶切鉴定。

　　1.4 质粒的转染及筛选

　　大量制备含pcDNA3/HIF1α表达质粒，PEG 8000纯化，脂质体包裹转染HepG2细胞步骤均按试剂盒说明书进行。稳定细胞的筛选方法如下：转染后培养24 h，细胞增长接近汇合时按1∶4密度传代，待细胞密度增至50%～70%汇合时加G418;弃培养液，PBS漂洗，加入200 μg/mL的G418筛选培养基。根据培养基颜色和细胞生长情况，每3～5 d更换筛选培养基。筛选14 d后，可见有抗性的克隆出现，待其增大后挑单克隆，制备细胞悬液，用培养基稀释细胞到1个/10 μL。在96孔板中加入培养基150 μL/孔，再加入细胞悬液10 μL/孔，待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

　　1.5 HIF1α蛋白的表达检测

　　取对数生长的转染HIF1α HepG2细胞，接种于含玻片的6孔板内， 24 h后PBS洗涤细胞，置含2%H2O2的50%甲醇中固定，风干，血清封闭，加入HIF1α一抗，4 ℃过夜，再加入荧光二抗，荧光显微镜下观察，同时测定3个标本，并与原始细胞进行比较。

　　1.6 转染后HIF1α效果鉴定

　　pcDNA3/HIF1α转染48 h后检测HIF1α蛋白的表达。三去污剂法提取HepG2细胞内总蛋白，凝胶电泳，电转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉，加入1∶1 000 稀释鼠抗多克隆抗体，室温孵育过夜，加入碱性磷酸酶羊抗鼠二抗，室温孵育2 h，ECL显影。

　　1.8 数据分析

　　用SPSS 13.0统计软件包对数据进行分析，数据采用均数±标准差(x±s)表示，以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 HIF1α核苷酸的构建与鉴定

　　取pcDNA3/HIF1α阳性克隆小量制备质粒，经BamH I和Xba I酶切后，琼脂糖凝胶电泳，显示两条条带，分别为5.3 kb和2.55 kb，与pcDNA3和扩增HIF1α的大小一致，见图1。

　　图1 构建质粒的酶切结果

　　1 分子量标准;2 酶切产物

　　2.2 序列测定结果

　　pcDNA3/HIF1α质粒测序，结果显示亚克隆片段与目标序列的理论序列完全一致,pcDNA3/HIF1α构建正确。

　　2.3 HIF1α蛋白检测结果

　　荧光显微镜发现荧光标记的HIF1α主要集中于细胞核(图2);SDSPAGE凝胶电泳分析：HIF1α转染细胞组(25.3±2.6)的含量分别是对照组(12.1±2.0)的2.1倍，两组比较，t=4.8，P<0.01(图3)。

　　3 讨论

　　恶性肿瘤在生长过程中，由于组织增生过快必然会造成局部组织严重缺氧和供能与耗能之间的不平衡。HIF1α能通过诱导VEGF和糖酵解相关酶的表达，改善这一失衡。Zhong等[3]提出实质性肿瘤有两个主要特征：大量新生血管形成和糖酵解活性增强。这使肿瘤细胞能适应缺氧微环境，与肿瘤的侵润、转移和预后密切相关。HIF1在这一过程中起中心介导作用，其中HIF1α最关键。有人对皮肤、肝、胃、结肠、肾、胰腺、乳腺、前列腺、卵巢[4-6]分别作了分析，发现在这些癌组织中，HIF1α过表达、且在肿瘤坏死明显区域和肿瘤浸润边缘表达明显增多，而肿瘤组织内的基质细胞和邻近正常组织则未见HIF1α的表达;Sun等[7]在动物实验中证实用基因转染封闭HIF1α能增强抗肿瘤免疫效力，推测与野生型P53基因的募集和肿瘤细胞凋亡有关。故已有人将HIF1α作为预测肿瘤某些生物学行为的指标。

　　为探究HIF1α在肝癌的发生机制，需要构建HIF1α稳定表达的肝癌细胞株。本实验利用RTPCR技术扩增出HIF1α全序列片段，经酶切后，将HIF1α基因插入真核表达载体pcDNA3中，构建pcDNA3/HIF1α的表达质粒，经酶切鉴定重组质粒的目的片段位于2.55 kb左右，载体片段位于5.3 kb，和预期结果一致，证明重组表达质粒pcDNA3/HIF1α表达载体构建成功。序列分析证实，所扩增的HIF1α片段与Genebank报道一致。重组质粒经扩增、中量抽提和鉴定后，将pcDNA3/HIF1α转染培养人肝癌细胞株HepG2，采用G418进行筛选，筛选浓度开始为200 μg/mL,剂量逐渐增加至1mg/mL,直至筛选出稳定表达HIF1α的细胞株。免疫荧光染色和WesternBlot分析证实肝癌HepG2细胞株HIF1α蛋白的表达明显上调。

　　HIF1α在肿瘤细胞内高度表达，且选择性地在肝癌等肿瘤中表达。该特异性决定其可作为肿瘤生物研究的重要参照物[8]。稳定表达HIF1α的肝癌细胞株HepG2的构建为研究HIF1α在研究肝癌的发生、发展、转移、预后提供一个可靠的工具。

　　【参考文献】

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