RP-HPLC法同时测定复方环昔滴眼液中两组分的含量

　　【摘要】 目的：建立同时测定复方环昔滴眼液中盐酸环丙沙星和阿昔洛韦的含量的RP-HPLC法。方法：采用Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以15∶15∶70比例的甲醇-乙腈-0.05 mol·L-1枸橼酸溶液(三乙胺调pH至3.5)为流动相，流速为0.8 mL·min-1;检测波长为253 nm。结果：盐酸环丙沙星和阿昔洛韦的线性范围分别为15.1～241.6 μg·mL-1(r=0.9993)和5.1～81.6 μg·mL-1(r=0.9998)，平均回收率分别为99.7%和99.8%，RSD分别为0.92%和0.65%。结论：本法快速准确，重现性好，适用于复方环昔滴眼液的质量控制。

　　【关键词】 反相高效液相色谱法;复方环昔滴眼液;盐酸环丙沙星;阿昔洛韦

　　Simultaneous Content Determination of Two Constituents in Compound Huanxi Eye-Drops by RP-HPLCZHU Xue-song，ZHU Yu， LI Chun-lei，ZHENG Fang Department of Pharmacy, Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442008,China)Abstract:Objective To establish a RP-HPLC method that can simultaneously determine the contents of ciprofloxacin hydrochloride and aciclovir in compound huanxi eye-drops.Methods The RP-HPLC was performed on a Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm,5 μm) , the mobile phase was composed of methanol-acetonitrile-0.05 mol·L-1 citric acid solution(adjusted to pH3.0 with triethylamine)with a ratio of 15∶15∶70, the flow rate was 0.8 mL·min-1, the detection wavelength was 253 nm.Results The linear ranges of ciprofloxacin hydrochloride and aciclovir were 15.1～241.6 μg·mL-1(r=0.9993)and 5.1～81.6 μg·mL-1( r=0.9998 ),respectively.The average recovery rates were 99.7% and 99.8% with RSD 0.92% and 0.65%，respectively.Conclusion The method is accurate and reliable for the quality control of compound huanxi eye-drops.

　　Key words:RP-HPLC;Compound huanxi eye-drops;Ciprofloxacin hydrochloride;Aciclovir

　　复方环昔滴眼液是郧阳医学院附属东风总医院开发的自制制剂，主要有效成分为盐酸环丙沙星(以环丙沙星计3 mg·mL-1)和阿昔洛韦(1 mg·mL-1)，主要辅料为透明质酸钠(2 mg·mL-1)。其中盐酸环丙沙星是第三代喹诺酮类广谱抗菌药物，阿昔洛韦为高效抗病毒药;透明质酸钠作为主要的辅料，与眼球表面黏蛋白具有一种特殊的亲和力，故具有缓释、物理增黏和铺展润湿能力[1]。目前国内已有用高效液相色谱法测定其他制剂中盐酸环丙沙星和阿昔洛韦各自含量的报道[2-4]，但该制剂目前尚未见同时测定二者含量的方法报道，为更好地控制该产品的质量，本研究中建立了同时测定复方环昔滴眼液中盐酸环丙沙星和阿昔洛韦的含量的反相高效液相色谱法，该法简便、快速、准确，可作为复方环昔滴眼液的质量控制方法。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器Ultimate 3000高效液相色谱仪(Ultimate 3000泵,Ultimate 3000二极管阵列检测器，四元低压混合系统，chromeleon工作站)，HS-2060超声仪,岛津AEU-210电子天平。

　　1.2 试药对照品

　　环丙沙星对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130451-200302,含量：84.9%);阿昔洛韦对照品(中国药品生物制品检定所，批号：140630-200602, 供含量测定用);复方环昔滴眼液(医院自制，批号：080818、080921、081014);甲醇、乙腈、三乙胺均为色谱纯，其他试剂为分析纯;水为注射用水。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件及系统适用性试验

　　色谱柱：色谱柱：Kromasil C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相：甲醇-乙腈-0.05 mol·L-1枸橼酸溶液(三乙胺调pH至3.5)，各组分比为15∶15∶70;检测波长：253 nm;流速：0.8 mL·min-1;柱温：室温;进样量：20 μL。在该色谱条件下，以图1 A-C计算，阿昔洛韦和盐酸环丙沙星的理论塔板数分别为3553和7241，两者分离度为13.6。

　　图1 高效液相色谱图(略)

　　A 阴性样品; B 对照品; C 样品　　1 阿昔洛韦 2 盐酸环丙沙星

　　2.2 溶液的配制

　　2.2.1 对照品溶液:分别精密称取环丙沙星对照品35.6 mg和105 ℃干燥3 h后的阿昔洛韦对照品10.2 mg置同一100 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液适量超声至溶解，加稀释溶剂甲醇-0.05 mol/L枸橼酸溶液(20∶80)至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液，其中环丙沙星和阿昔洛韦浓度分别为0.302 mg·mL-1和0.102 mg·mL-1。精密吸取混合对照品储备液5 mL置于25 mL量瓶中，加稀释溶剂至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

　　2.2.2 供试品溶液:精密吸取样品1.0 mL置50 mL量瓶中，加稀释溶剂至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.2.3 阴性样品溶液:按处方比例制备不含盐酸环丙沙星和阿昔洛韦的阴性样品溶液，并按“2.2.2”项下方法操作，制成阴性样品溶液。

　　2.3 标准曲线的制备

　　精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0 mL分置10 mL量瓶中，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品系列溶液。分别取上述溶液20 μL，依次注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品的浓度C(μg·mL-1)为横坐标，峰面积A为纵坐标，经线性回归，环丙沙星浓度在15.1～241.6 μg·mL-1范围内有良好的线性关系，回归方程为A=1.2048C+2.5342，(r=0.9993);阿昔洛韦浓度在5.1～81.6 μg·mL-1范围内有很好的线性关系，回归方程为A=2.0784C-0.2306(r=0.9998)。

　　2.4 干扰试验

　　取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液在上述色谱条件下各进样20 μL测定，记录色谱图，阴性样品对测定无干扰，见图1。

　　2.5 精密度试验

　　精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，环丙沙星峰面积的RSD为0.63%，阿昔洛韦峰面积的RSD为0.41%(n=6)。

　　2.6 重复性试验

　　取样品(批号：081014)6份，按样品测定方法测定，测得环丙沙星和阿昔洛韦含量的RSD分别为0.78%和0.67%。

　　2.7 稳定性试验

　　取供试品溶液，分别于0,2,4,6,8 h进样20 μL后测定环丙沙星和阿昔洛韦的峰面积，RSD分别为0.68%和0.55%(n=6)。

　　2.8 加样回收率试验

　　分别精密量取已知含量的样品(批号：081014)1.0 mL分置9个50 mL的量瓶中;分别精密量取混合对照品储备液4，5，6 mL各3份分置上述量瓶中，充分混匀，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，按含量测定项下进行测定，计算分别取上述溶液20 μL，依次注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。

　　2.7 样品测定

　　分别精密吸取“2.2.1”项下制得的混合对照品溶液及3个批号的供试品溶液，各进样20 μL，测定，每个批号平行3份，以外标法计算供试品的含量，结果见表2。

　　表1 回收率测定结果(略)

　　表2 样品含量测定结果(略)

　　3 讨论

　　在色谱柱的选择上，在同等的条件下，本研究中比较了如下几种色谱柱：Thermo ODS C18( 4.6 mm×150 mm,5 μm),Poresphere C18(4.6 mm×150 mm，5 μm),Hypersil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),Venusil XBP-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm),Acclaim 120 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm),Kromasil C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。观察发现使用前面5种柱子时，盐酸环丙沙星拖尾现象比较严重，理论塔板数均达不到2000，只有Kromasil C18 柱的柱效比较高，峰形好，如图1所示;而阿昔洛韦在以上几种柱子中的分离效果均比较满意，对色谱柱的要求相对较低，因此在分离与环丙沙星的性质与结构类似的物质时，色谱柱的选择是关键。

　　在流动相的选择时，参考文献[2]后，主要采用能较好分离环丙沙星的流动相成分与比例，同时兼故阿昔洛韦，经过反复试验，最终选择如“2.1.1”项下的流动相，结果亦同样证实该条件下环丙沙星和阿昔洛韦的峰形好，保留时间适宜，柱效高，分离效果较好。

　　由“2.2.2”项下的供试品溶液在200~350 nm波长范围内二极管阵列检测器在线扫描图谱可可知，环丙沙星和阿昔洛韦的最大吸收波长分别为280 nm、253 nm。比较二者在各自最大吸收波长处的峰面积，尽管两者含量相差仅3倍但环丙沙星峰面积几乎是阿昔洛韦的7倍。为了减少试验误差，增加检测的灵敏度，本研究中将检测波长设定为253 nm。

　　本文采用高效液相色谱法同时测定复方环昔滴眼液中环丙沙星和阿昔洛韦的含量，方法简便、准确，重复性好，专属性强，可作为该自制制剂的质量控制方法。

　　【参考文献】

　　1] 杨桂兰,郭学平,栾贻宏.不同相对分子质量透明质酸钠的应用[J].食品与药品,2005,7(12):1-3.

　　[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版，2005：289,527.

　　[3] 马 力,程 斌,岑 丽.高效液相色谱法测定复方阿昔洛韦乳膏中阿昔洛韦和甲硝唑的含量[J].中国医院药学杂志，2005，25(7):636-637.

　　[4] 孙文武，张小平，汪 筠.HPLC法同时测定复方环丙沙星滴耳液中2种组分的含量[J].中国药师,2005,8(3):223-224.

　　[5] 郑 芳,刘 菁,朱雪松,等.RP-HPLC法同时测定复方诺氟沙星滴耳液中两组分的含量[J].郧阳医学院学报,2009,28(1):36-38.