卵裂球细胞乙型肝炎病毒FISH检测法的建立

　　【摘要】 目的：建立一种灵敏、特异的卵裂球细胞乙型肝炎病毒(HBV)感染的检测方法。方法:根据HBV基因上的保守序列设计并合成引物，应用PCR技术制备探针并进行生物素标记。废弃的胚胎卵裂球经激光打孔，活检2～4个卵裂球细胞，利用生物素标记的探针，应用荧光原位杂交技术(FISH)检测HBV感染情况。结果:在HBV的感染者的38例子代胚胎卵裂球细胞，11例呈现阳性信号，健康对照组未检测到阳性信号。结论:荧光原位杂交技术(FISH)可用于卵裂球细胞HBV感染的检测，在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)实践中对降低HBV垂直传播有重要意义。

　　【关键词】 乙型肝炎病毒;卵裂球;荧光原位杂交技术;垂直传播

　　Establishment of a FISH Method for HBV Detection in Human BlastomereZHANG Chang-jun,YANG Jing-ning,WANG Hua,LUO Qing-bing,PENG Hai-yin,DONG Yi-fei (Research Center of Reproductive Medicine,Renmin Hospital;Department of Immuology,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,ChinaAbstract:Objective To establish a sensitive and specific method for the detection of HBV in human blastomere.Methods According to the specific sequence of HBV genes,the primers were designed and synthesized,DNA probe was prepared by polymerase chain reaction (PCR) amplification and labeled with biotin.Discarded embryos were drilled by laser, and 2～4 cells were taken for biopsy.Fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed to detect the existence of HBV DNA in the blastomere by using the biotinylated probe.Results FISH detection showed that 11 cases of 38 embryos from patients with HBV infection were positive,while no positive signal was found in healthy controls.Conclusion FISH technique could be performed for the detection of HBV in human blastomere cells,and it has great significance to reduce vertical transmission of HBV in IVF-ET.

　　Key words:Hepatitis B virus;Blastomere;Fluorescence in situ hybridization;Vertical transmission

　　乙型病毒性肝炎由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起，在HBV传播途径中,垂直传播居重要地位，垂直传播包括母婴传播和父婴传播,事实上HBV的可能通过生殖细胞传播[1]。在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)实践中，胚胎植入前可进行遗传学诊断被称为植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD),能有效预防一些遗传性疾病的发生[2]。同样道理，胚胎植入前可进行胚胎HBV感染的诊断，舍弃已经受HBV感染的胚胎，可降低HBV的垂直传播。因此,探讨建立一种灵敏、特异的卵裂球细胞HBV感染的检测方法，对控制HBV垂直传播,降低人群中HBV的感染率，具有重要意义。为此,作者对本中心进行IVF-ET治疗的HBV感染者进行研究，应用HBV特异性探针，建立一种卵裂球细胞HBV检测的FISH技术。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　本研究经院伦理委员会批准同意，且具有每位患者知情同意书 。在本中心进行IVF-ET治疗的不孕或不育夫妇作为研究对象，依HBV感染情况分为二组：A组38对夫妇:男方或女方乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性或乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性;B组为对照组，5对健康的夫妇,HBV标志阴性。

　　1.2 方法

　　1.2.1 探针制备：本研究用探针由聚合酶链反应(PCR)技术制备，所用引物基于流行的主要亚型(adr)并参考Shigenobu等[3]的方法而设计，由上海英骏生物公司合成，上游引物5′-GAACTCCTA GCAGCTTGTTT-3′，下游引物5′-TGAACAGTAGGAGATGAACA-3′，扩增产物约591 bp,使用HBV感染血清HBV DNA为模板，扩增条件为:95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,60 s;30个循环;最后72 ℃,10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB显色，鉴定片段大小后，胶回收纯化，送样测序进一步鉴定。

　　经测序鉴定的扩增产物，用生物素标记试剂盒(Boehringer Mannheim,德国)进行生物素标记。

　　1.2.2 胚胎活检与固定：液氮冻存的废弃胚胎，解冻后转入胚胎活检液微滴(50 μL)中，在倒置显微镜(Nikon，日本)下，激光打孔，波长1 840 nm，用活检针取出卵裂球细胞。用钻石笔于多聚赖氨酸处理的玻片表面画一个直径约3 mm的圆圈，吸取卵裂球细胞置入圆圈内，用固定液(0.01 mol/L HCl,0.1% Tween 20)小心处理，直至胞浆完全溶解。然后置玻片于100 μg/mL胃蛋白酶溶液中37 ℃作用20 min。玻片经系列乙醇溶液脱水，空气干燥，置-20 ℃备荧光原位杂交用。

　　1.2.3 FISH:荧光原位杂交技术参照Conn等[4]的方法,略作改进,具体方法如下述。玻片置73 ℃、75%甲酰胺/2×氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)变性3 min,经系列冷乙醇溶液脱水，空气干燥。探针同时95 ℃变性5 min，取10 μL探针覆盖于每张玻片待杂交区域，加盖玻片，用橡胶水泥密封，置一潮湿暗盒内， 37 ℃过夜(大约16 h)。杂交后洗涤于45 ℃ 50%甲酰胺/2×SSC溶液洗涤3次，每次5 min，然后于2×SSC溶液中漂洗一次。杂交区域加入FITC-avidin溶液(Sigma,美国)37 ℃作用20 min,经3次洗涤，用生物素标记的抗亲合素抗体(Vector Laboratories,USA)覆盖，37 ℃作用30 min，经3次洗涤，再加入FITC-avidin溶液37 ℃作用20 min，经3次洗涤后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)/抗荧光衰减封片剂(Antifade)10 μL(Vysis,美国)染色。置荧光显微镜(BX51 TRF,Olympus,日本)下观察，并采集图像。

　　2 结果

　　2.1 HBV DNA扩增产物鉴定

　　扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示，产物片段大小与预期一致(图1)。健康病人血清DNA无条带出现。纯化PCR产物测序，测序结果如图2所示，经与GENE BANK比对，确认为HBV主要亚型(adr)的扩增产物。

　　图1 HBV DNA 扩增产物的凝胶电泳鉴定(略)

　　1:Fast RulerTM DNA Ladder;2:HBV DNA扩增产物;3:阴性对照

　　2.2 荧光原位杂交

　　在A组38对夫妇，其中11例胚胎卵裂球细胞检测到1～2个杂交信号(图3A、3B,FISH×1 000)，说明受到HBV感染, 在受感染胚胎的活检细胞中，几乎每个细胞都受到HBV感染(图3D,FISH×400)。B组为健康对照组，均未检测到HBV的感染(图3C,FISH×1000)。

　　3 讨论

　　我国是乙肝高发区，HBV携带率很高，HBV传播包括水平传播和垂直传播，而垂直传播在HBV代代相传的恶性循环中起重要作用。研究发现，HBV并非专一的嗜肝病毒，许多肝外组织和细胞如心脏、胰腺、肾脏、脾脏、睾丸、胆道上皮、皮肤、精子与外周血白细胞，均可检出HBV DNA[1，5]。因此，HBV有可能感染并整合于生殖细胞，可能通过生殖细胞把病毒垂直传播给子代[6]。

　　在IVF-ET实践中，胚胎植入前进行卵裂球细胞活检，通过遗传学分析,能有效预防一些遗传性疾病的发生。因为，理论上任何一个卵裂球细胞有可能单独发育为一个个体，活检少数的卵裂球细胞并不影响胚胎的发育。同样，胚胎植入前进行卵裂球细胞活检，检测HBV的感染情况，理论上应该能有效降低HBV传播。

　　卵裂球细胞HBV感染的检测，理论上可应用聚合酶链反应(PCR)技术，但卵裂球细胞获得成本高，细胞很少，只有1～8个，提取PCR模板时，容易丢失或者污染，并且卵裂球细胞被裂解，重复性较差[7]。此外，PCR技术的实验结果，不直观，患者难以理解。

　　而荧光原位杂交技术(FISH)可对单个细胞进行检测，并且可多次重复检测，可以多次检测同一个指标，也可以是不同的指标，能够定位于某一染色体，其检测结果直观，容易为患者理解和认同[1,8]。因此，探索利用FISH技术，进行胚胎HBV感染的检测，在方法学上具有重大意义。

　　本研究通过制备HBV特异性探针，利用FISH技术，在11对夫妇(A组，HBV感染者)的胚胎卵裂球细胞检测到阳性信号，说明受到HBV感染，而在B组(健康对照组)，均未检测到HBV的感染。FISH结果表明，在受感染胚胎的活检细胞中，几乎每个细胞都受到HBV感染，说明HBV随着细胞增殖而扩散到早期胚胎的所有细胞。因此，活检卵裂球少数细胞，基本上可以反映此卵裂球的HBV感染情况，同时，并不会影响胚胎的发育。由此可见，胚胎植入前进行卵裂球细胞活检，通过FISH检测可反映HBV感染情况，舍弃已经受HBV感染的卵裂球，而尽可能植入未受HBV感染的胚胎卵裂球，达到降低HBV垂直传播的目的。

　　因此本研究成功建立了一套胚胎卵裂球HBV感染的检测技术，在IVF-ET过程中，能对植入的胚胎进行筛选，达到阻止或减低HBV垂直传播，具有重大的临床应用价值。中图2~3见封三)(略)

　　【参考文献】

　　1] 赵连三，刘晓梧，张智翔，等.乙型肝炎病毒经精子传播的可能性研究[J].中华传染病杂志，1998，16(3):154-157.

　　[2] Li M,DeUgarte CM,Surrey M,et al.Fluorescence in situ hybridization reanalysis of day-6 human blastocysts diagnosed with aneuploidy on day 3[J].Fertil Steril.2005，84(5):1 395-1 400.

　　[3] Kawai S,Yokosuka O,Imazeki F,et al.State of HBV DNA in HBsAg-negative,anti-HCV-positive hepatocellular carcinoma:existence of HBV DNA possibly as nonintegrated form with analysis by Alu-HBV DNA PCR and conventional HBV PCR[J].J Med Virol,2001,64(4) :410-418.

　　[4] Conn CM,Cozzi J,Harper JC,et al.Preimplantation genetic diagnosis for couples at high risk of Down syndrome pregnancy owing to parental translocation or mosaicism[J].J Med Genet,1999,36(1):45-50.

　　[5] 骆抗先主编.乙型肝炎-基础和临床[M].北京：人民卫生出版社,1996:51-270.

　　[6] Hadchouel M,Scotto J,Huret JL,et al.Presence of HBV DNA in spermatozoa:a possible vertical transmission of HBV via the germ line[J].J Med Virol,1985,16(1):61-66.

　　[7] Navidi W,Arnheim N.Using PCR in preimplantation genetic disease diagnosis[J].Hum Reprod,1991,6(6):836-849.

　　[8] Shkumatov A,Kuznyetsov V,Cieslak J,et al.Obtaining metaphase spreads from single blastomeres for PGD of chromosomal rearrangements[J].Reprod Biomed Online,2007,14(4):498-503.